胡 群，馬思杰，鄒春穎，童淑梅，梅 勇

寧波野生鼠類攜帶的沙粒病毒檢測(cè)和種系進(jìn)化分析

胡 群，馬思杰，鄒春穎，童淑梅，梅 勇

目的 對(duì)寧波地區(qū)野生鼠類攜帶的沙粒病毒進(jìn)行檢測(cè)并分析病毒基因序列特征。方法 設(shè)計(jì)沙粒病毒L、S基因的簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR方法對(duì)寧波口岸捕獲的鼠類樣品進(jìn)行沙粒病毒檢測(cè)，分離病毒，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果 共檢測(cè)73份鼠類樣品，其中12份褐家鼠經(jīng)檢測(cè)為陽(yáng)性，分離獲得沙粒病毒株DX1401，該病毒株S片段擴(kuò)增片段大小為413 bp，L片段擴(kuò)增大小1 204 bp。S片段的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示DX1401與Mobala 病毒株ACAR3080位于同一分支，與Mobala 病毒株ACAR3080遺傳距離最為接近，值為0.467；L片段的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示DX1401與Lassa病毒株Josiah、NL、Z148、Bamba-R114、Soromba-R、Nig08-A37、Nig08-A47, Mobala病毒株ACAR3080，Morogoro病毒株13017/2004，Mopeia病毒株Mozambique、AN 21366-BNI位于同一組，與Mobala 病毒株ACAR 3080遺傳距離最為接近，值為6.953。結(jié)論 本研究證實(shí)了寧波地區(qū)野生鼠類中存在沙粒病毒流行。

鼠類；沙粒病毒；檢測(cè)；系統(tǒng)發(fā)生分析

Funded by the Science Project of Natural Science Foundation of Ningbo (No. 2013A610240)

沙粒病毒(arenavirus)屬于沙粒病毒科(arenaviridae)沙粒病毒屬(arenavirus)，為有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組由L和S兩個(gè)節(jié)段組成，已知至少由23種病毒組成，一些新的沙粒病毒還在不斷的發(fā)現(xiàn)中[1]。主要引起的人類疾病有淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎、拉沙熱、阿根廷出血熱、和玻利維亞出血熱等，其中鼠類攜帶和感染淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)，主要分布在歐美和亞洲，國(guó)內(nèi)曾有少數(shù)病例。拉沙熱病毒(Lassa virus，LASV)主要發(fā)生在西非，能引起發(fā)熱、頭疼、肌痛等癥狀，嚴(yán)重有出血和休克，病死率為15%～25%。鳩寧病毒(Junin virus，JUNV)、馬秋波病毒(Machupo virus，MACV)、瓜納瑞托病毒(Guanarito virus)能引起人類出血性疾病，而且感染性極高[2-3]。雖然，我國(guó)目前尚未有沙粒病毒感染病例的報(bào)道，但是為了了解寧波地區(qū)鼠樣品中是否存在沙粒病毒的自然感染情況，我們依據(jù)沙粒病毒特有蛋白質(zhì)氨基酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)分別擴(kuò)增沙粒病毒L、S片段特定基因的簡(jiǎn)并引物，以寧波口岸地區(qū)捕獲的73只鼠類樣品為模板，進(jìn)行沙粒病毒篩查，并對(duì)分離的病毒株進(jìn)行了遺傳學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 2013年6月至12月期間從寧波北侖港區(qū)監(jiān)測(cè)點(diǎn)捕獲73只鼠類樣品，鼠種構(gòu)成為黑線姬鼠(Apodemus agrarius)26只、褐家鼠(Rattus norvegicus)25只、臭鼩(Suncus murinus)13只、小家鼠(Mus musculus)6只、社鼠(Rattus niviventer)3只。

1.2 試劑 Ribounclease inhibition、100bp ladder marker、瓊脂糖均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，病毒RNA 提取試劑盒、一步法 RT-PCR 試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒RNA提取 取約50 mg鼠肺樣品，研磨勻漿后參照Qiagen公司RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書提取病毒RNA，用40 μL無(wú)RNA酶的超純水溶解，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物合成 根據(jù)基因庫(kù)中不同沙粒病毒屬的病毒聚合酶蛋白氨基酸序列和核蛋白N氨基酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增沙粒病毒L基因片段和S基因片段兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，委托上海英駿生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 沙粒病毒L和S基因片段引物

1.3.3 RT-PCR反應(yīng)體系 采用一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行病毒模板目標(biāo)基因片段擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)：其中 RNase Free Water 19 μL ，5×RT-PCR Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，Enzyme Mix 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL，20 μmol/L 上游引物 4 μL，下游引物 2 μL，RNA模板10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 1 min，42 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。剩余擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英俊生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到的片段序列登錄NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性較為接近的沙粒病毒代表株進(jìn)行種系進(jìn)化分析，利用Mega5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹和計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)和病毒分離 12份從褐家鼠中分離的鼠肺樣品經(jīng)RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，褐家鼠病毒陽(yáng)性率達(dá)到48%，S基因片段與L基因片段檢測(cè)結(jié)果一致。選擇陽(yáng)性較強(qiáng)的3份鼠肺，制成20%懸液接種于Vero-E6細(xì)胞培養(yǎng)后，成功分離到1株病毒株，命名為DX1401，該病毒株再次經(jīng)沙粒病毒L基因和S基因簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后可見明顯的陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，條帶大小約為413 bp和1 204 bp，與預(yù)期大小一致。電泳條帶位置，見圖1。

1:S基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小約413 bp；2:L基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小約1 204 bp；M:分子量對(duì)照

2.2 測(cè)序及同源性比對(duì) 將病毒株DX1401的 S、L片段測(cè)序序列，上傳至GenBank，獲得登錄號(hào)分別為KJ144198.1和KJ144197.1。通過(guò)Blast檢索與GenBank收錄的病毒株親源性比較，檢索所獲得的100個(gè)相似序列均為沙粒病毒屬病毒相應(yīng)基因片段，S片段與其他病毒基因片段相似度范圍為72%～83%，L片段與與其他病毒基因片段相似度范圍為66%～93%。

2.3 種系進(jìn)化分析 根據(jù)Blast同源性比對(duì)結(jié)果，選擇與病毒株DX1401親緣關(guān)系較近的不同沙粒病毒代表株，分別構(gòu)建S基因和L基因種系進(jìn)化樹。S基因種系進(jìn)化分析結(jié)果見圖2可知，DX1401與Mobala病毒ACAR3080位于同一分支。L基因種系進(jìn)化分析結(jié)果見圖3可知，DX1401與Lassa病毒株Josiah、NL、Z148、Bamba-R114、Soromba-R、Nig08-A37、Nig08-A47, Mobala病毒株ACAR3080，Morogoro病毒株13017/2004，Mopeia病毒株Mozambique、AN 21366-BNI位于同一組。

2.4 遺傳距離分析 從表3可知， DX1401與沙粒病毒屬M(fèi)obala 病毒株ACAR 3080遺傳距離最為接近，S基因和L基因所對(duì)應(yīng)的遺傳距離分別為0.467和6.953。

表2 DX1401與不同沙粒病毒間S基因和L基因基因距離

注：“-”表示GenBank里未收錄該病毒株所對(duì)應(yīng)的基因序列

Note:“-” means the corresponding gene sequences of the virus strain were not recorded in the GenBank.

圖2 不同沙粒病毒 S基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

圖3 不同沙粒病毒 L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

沙粒病毒是一類由嚙齒動(dòng)物為宿主、能夠以多種方式感染并引起人類不同程度病死率疾病的 RNA 病毒, 近來(lái)陸續(xù)有各種沙粒病毒被檢測(cè)分離的報(bào)道[4-7]。但是目前國(guó)內(nèi)的沙粒病毒的檢測(cè)研究依然非常少，在鼠類自然疫原性感染方面的研究更處于空白。

本研究采用了CODEHOP方法設(shè)計(jì)沙粒病毒科的簡(jiǎn)并引物，所設(shè)計(jì)引物由3′端簡(jiǎn)并的核心區(qū)和5′端為非簡(jiǎn)并夾板區(qū)2個(gè)部分組成，與常規(guī)方法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物相比具有簡(jiǎn)并度低、退火溫度高、特異性更強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[8-11]。沙粒病毒基因組RNA分大小兩個(gè)片段：大片段L長(zhǎng)7.2～7.5 kb，包含3′的L基因和5′端的Z基因，分別編碼病毒的RNA聚合酶蛋白L和一種可能具有轉(zhuǎn)錄復(fù)制調(diào)節(jié)功能的Z蛋白。小片段S長(zhǎng)3.4～3.5 kb，包含3′端的N基因和5′端的G基因，分別編碼病毒的核蛋白N和病毒前體糖蛋白G。根據(jù)CODEHOP方法設(shè)計(jì)原理，首先從基因庫(kù)里獲取不同沙粒病毒株RNA聚合酶蛋白L和核蛋白N的氨基酸序列，然后分別尋找蛋白質(zhì)上的保守氨基酸區(qū)域，進(jìn)一步挑選兩個(gè)保守區(qū)域作為上下游引物的設(shè)計(jì)位點(diǎn)，所獲得的兩對(duì)簡(jiǎn)并引物能夠分別擴(kuò)增沙粒病毒L片段和S片段的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，從而能夠檢測(cè)沙粒病毒科內(nèi)不同基因型別的病毒[12]，從寧波口岸監(jiān)測(cè)捕獲的鼠類樣品檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，證實(shí)了寧波口岸鼠類樣品中存在沙粒病毒感染的情況，褐家鼠為該病毒的自然宿主，陽(yáng)性率高達(dá)48%。

將分離的沙粒病毒株DX1401擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列上傳至GenBank進(jìn)行Blast同源性檢索，所獲得的100個(gè)同源性較為接近的序列來(lái)源均為沙粒病毒，隨后從中選擇典型的沙粒病毒株進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析，從構(gòu)建的兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹和遺傳距離分析來(lái)看，DX1401與Mobala 病毒株ACAR 3080的親源關(guān)系最為接近，該病毒株最早是在1983年從非洲的柔毛鼠(African soft-furred rat)中分離[13]，已有的資料顯示，Mobala病毒并不引起人類的疾病[14-15]。

[1]Xiong CH, Jiang QW. Review: Arenaviruses[J]. Chin J Dis Ctrl Prev, 2009, 13(3): 362-365. (in Chinese) 熊成龍, 姜慶五. 沙粒病毒的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)疾病控制雜志, 2009, 13(3): 362-365.

[2]Ishii A, Thomas Y, Moonga L, et al. Molecular surveillance and phylogenetic analysis of Old World arenaviruses in Zambia[J]. J Gen Virol, 2012, 93(10): 2247-2251. DOI: 10.1099/vir.0.044099-0

[3]Emonet SE, Urata S, de la Torre JC. Arenavirus reverse genetics: New approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies[J]. Virology, 2011, 411(2): 416-425. DOI: 10.1016/j.virol.2011.01.013

[4]Gonzalez JP, McCormick JB, Saluzzo JF, et al. An arenavirus isolated from wild-caught rodents (Pramys species) in the Central African Republic[J]. Intervirology, 1983, 19(2): 105-112.

[5]Yama IN, Cazaux B, Britton-Davidian J, et al. Isolation and characterization of a new strain of lymphocytic choriomeningitis virus from rodents in southwestern France[J]. Vector Borne Zoonotic Dis, 2012, 12(10): 893-903. DOI: 10.1089/vbz.2011.0892

[6]Kessell A, Hyatt A, Lehmann D, et al. Cygnet River virus, a novel orthomyxovirus from ducks, Australia[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(12): 2044-2046. DOI: 10.3201/eid1812.120500

[7]Palacios G, Savji N, Hui J, et al. Genomic and phylogenetic characterization of Merino Walk virus, a novel arenavirus isolated in South Africa[J]. J Gen Virol, 2010, 91(5): 1315-1324. DOI: 10.1099/vir.0.017798-0

[8]Rose TM, Henikoff JG, Henikoff S. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer design[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(13): 3763-3766. DOI: 10.1093/nar/gkg524

[9]Rose TM, Schultz ER, Henikoff JG, et al. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(7): 1628-1635.

[10]Zlateva KT, Crusio KM, Leontovich AM, et al. Design and validation of consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for broad and sensitive detection of corona-and toroviruses[J]. J Virol Methods, 2011, 177(2): 174-183. DOI: 10.1016/j.jviromet.2011.08.005

[11]Baines JE, McGovern RM, Persing D, et al. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) for the detection of novel papillomaviruses and their application to esophageal and tonsillar carcinomas[J]. J Virol Methods, 2005, 123(1): 81-87.

[12]Hu Q, Ma SJ, Qiu JL, et al. Development of CODEHOP RT-PCR to detect Arenaviruses carried by rodent[J]. J Pan Biol, 2013, 8(12): 1074-1077. (in Chinese) 胡群, 馬思杰,裘炯良,等.鼠類感染沙粒病毒CODEHOP RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2013,8(12):1074-1077.

[13]Gonzalez JP, Mccormick JB, Georges AJ, et al. Mobala virus: Biological and physicochemical properties of a new arenavirus isolated in the Central African Republic[J]. Virologie, 1984, 135(2): 145-158. DOI: 10.1016/S0769-2617(84)80051-9

[14]Vieth S, Drosten C, Lenz O, et al. RT-PCR assay for detection of Lassa virus and related Old World arenaviruses targeting the L gene[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2007, 101(12): 1253-1264.

[15]Gunther S, Hoofd G, Charrel R, et al. Mopeia virus-related arenavirus in natal multimammate mice, Morogoro, Tanzania[J]. Emerg Infect Dis, 2009, 15(12): 2008-2012. DOI: 10.3201/eid1512.090864

Detection and phylogenetic analysis of arenavirus carried by wild rodents in Ningbo, China

HU Qun,MA Si-jie,ZHOU Chun-yin,TONG Shu-mei,MEI Yong

(DaxieExit-EntryInspectionandQuarantineBureau,Ningbo315812,China)

To detect and phylogeneticaly analyze arenavirus carried by wild rodents in Ningbo, China, two pairs of degenerate-primers were designed to amplify the S and L gene of arenavirus, and then RT-PCR was applied to detect arenavirus carried by rodents which captured from Ningbo port area. All 73 rodents samples were detected, of which 12Rattusnorvegicuswere positive, an arenavirus virus strain named DX1401 were separated. The S gene amplified products of DX1401 was about 413 bp, and the L gene was 1 204 bp. The phylogenetic analysis of S segments showed that DX1401 strain was in one branch of phylogenetic tree with Mobala virus strain ACAR3080. The genetic distance to Mobala virus strain ACAR3080 was the closest, with the value of 0.467; the phylogenetic analysis of L segments showed that DX1401 strain were in one group of phylogenetic tree with Lassa virus strain Josiah, NL, Z148, Bamba-R114, Soromba-R, Nig08-A37, Nig08-A47, Mobala virus strain ACAR3080, Morogoro virus strain 13017/2004, Mopeia virus strain Mozambique, and AN 21366-BNI. The genetic distance to Mobala virus strain ACAR3080 was the closest, with the value of 6.953. In conclusion, the study confirmed the existence of arenavirus popular in wild rodents in Ningbo, China.

rodents; arenavirus; detection; phylogenetic analysis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.010

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013A610240)

大榭出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧波 315812; Email: nbhuqun@sina.com

R373.9

A

1002-2694(2015)03-0235-05

2014-06-09；

2014-10-22