王二強(qiáng)，劉坪，徐小丹，孟娟娟，王仙，侯雋，吳向未，陳雪玲*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832008)

棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球絳蟲的幼蟲寄生于宿主體內(nèi)引起的人獸共患疾病[1]，又稱包蟲病。細(xì)粒棘球蚴病其特征是囊性病變，最常見于肝臟，約占病例的50%～70%[2]。許多研究者通過對(duì)受感染的人和動(dòng)物的研究，初步建立了繼發(fā)感染動(dòng)物模型[3]。繼發(fā)性感染主要包括腹腔、皮下以及肝臟穿刺注射原頭蚴等多種途徑，大部分動(dòng)物模型集中在腹腔注射頭節(jié)造模[4-8]。細(xì)粒棘球蚴感染約70%寄居在肝臟，所以從腹腔感染再遷移到肝臟，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染的研究具有一定的局限性。本研究旨在通過肝被膜下注射細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)，形成細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型，更好的研究包蟲病，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 耗材與儀器

主要試劑耗材：1 mL/50 mL注射器購(gòu)自KDL/康德萊。伊紅和HE染色試劑盒索萊寶，天狼猩紅染色染色液來(lái)自上海舜田生物科技有限公司，胎牛血清來(lái)自gibico，1640培養(yǎng)基，PBS來(lái)自生工，青鏈霉素混合液和中性樹膠來(lái)自索萊寶，水合氯醛(目錄號(hào)：C804539)來(lái)自Macklin公司，1.5 mLEP管和吸頭來(lái)自中國(guó)biosharp公司，100 mm培養(yǎng)皿和75 mm培養(yǎng)瓶來(lái)自美國(guó)康寧公司。手術(shù)縫合針來(lái)自Polyamide(3/8，3*10)，無(wú)水乙醇、95%乙醇和二甲苯來(lái)自天津富宇精細(xì)化工有限公司。

主要儀器：德國(guó)徠卡全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica RM2265)，蔡司生物顯微鏡(Axio Imager 2)，自動(dòng)組織脫水機(jī)(Leica PELORIS II)，移液器來(lái)自德國(guó)eppendorf公司，CO2的培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司(Heracell 240i)。

1.2 原頭蚴的提取以及體外培養(yǎng)

從新疆昌吉屠宰場(chǎng)購(gòu)買有肝包蟲囊腫的羊肝臟，流水沖洗3～5遍，然后在肝臟表面噴灑75%乙醇消毒。消毒后的的羊肝，用50 mL注射器提取囊泡中含頭節(jié)的囊液，然后移到高壓好的玻璃瓶。將裝有提取好的頭節(jié)和囊液的混合物的瓶子經(jīng)75%酒精消毒后，移到無(wú)菌操作臺(tái)，棄去上清液，留下底層白色頭節(jié)沉淀層，然后倒入PBS，搖晃瓶子混勻，待大部分頭節(jié)沉淀后，棄去上清液，重復(fù)30次左右后，用加樣槍吸取頭節(jié)，移入100 mm培養(yǎng)皿。加入10 mL左右的PBS，用移液器吹打混勻，然后棄去上清液，如果看到囊皮，用移液器吸住，然后棄入廢液缸，重復(fù)洗滌10次以上，直至沉淀后的上清液呈無(wú)色透明。然后培養(yǎng)皿留5 mL左右的液體，傾斜培養(yǎng)皿30°左右，待蟲子在中間形成1條白色沉淀帶，靜止10 s后，輕微搖晃，用移液器吸走沉淀帶上層容易上下漂浮的大顆粒(狀態(tài)不佳或者已死亡的蟲子)，重復(fù)10次左右，直至大部分頭節(jié)容易沉淀且顏色純白色(若顏色發(fā)黃，則提示沒有洗好，需要重新洗)。多次洗頭節(jié)主要是為了減少污染的風(fēng)險(xiǎn)以及提高頭節(jié)的活性保證接種的成功率。將購(gòu)買的成品1640培養(yǎng)基，然后按照8%胎牛血清，1%雙抗配置成完全培養(yǎng)基，洗好的頭節(jié)用移液器移入75 mm的培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基，充分混勻，在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.3 頭節(jié)活性的測(cè)定

用移液器混勻含細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)的培養(yǎng)基，吸取50 μL至玻片上，加入5 μL伊紅，混勻，靜止10 s，在顯微鏡的低倍鏡下計(jì)數(shù)，全部深染紅色的頭節(jié)為死亡的頭節(jié)，計(jì)數(shù)3個(gè)視野下蟲子的測(cè)算其存活率。

1.4 手術(shù)的準(zhǔn)備

6～8周齡雌性C57小鼠，體重18～22 g，購(gòu)買自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，本實(shí)驗(yàn)已通過石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查。

將含有頭節(jié)的培養(yǎng)基用加樣槍吹打混勻，吸出50 μL混合物滴加在玻片上，然后加入5 μL伊紅染液，均勻涂抹在玻片上，計(jì)數(shù)蟲子數(shù)目及活性≥90%的頭節(jié)，然后分別吸取3 000個(gè)頭節(jié)，5 000個(gè)頭節(jié)，PBS放置于不同的1.5 mL的EP管中。

手術(shù)器械的準(zhǔn)備：取0號(hào)(規(guī)格為3/8，3*10)手術(shù)縫合針，穿入縫合線(規(guī)格為5-0，線長(zhǎng)30 cm)，打1個(gè)小結(jié)，然后放入75%乙醇溶液中，準(zhǔn)備好碘伏，棉棒，經(jīng)過高壓滅菌處理的手術(shù)器械(包括眼科鉗，眼科鑷，2個(gè)持針器，鈍性分離器)以及手術(shù)操作臺(tái)(手術(shù)操作前，用75%乙醇溶液擦拭，并用紫外燈照射30 min)，麻醉藥的量每只老鼠按照體重乘以0.01 mL的5%水合氯醛，腹腔注射。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心取回小鼠，右手抓住鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)上，用左手的拇指、食指和中指抓住小鼠兩耳后項(xiàng)背部皮毛，以無(wú)名指及小指夾住鼠尾，左手操作注射器，腹腔注射0.2 mL左右的5%水合氯醛。已麻醉好的小鼠固定在手術(shù)操作臺(tái)上，腹中線附近的皮膚依次經(jīng)過碘伏和酒精消毒。用眼科鑷夾起表層皮膚，眼科剪剪出小口，插入鈍性分離器，分離表層皮膚和內(nèi)層皮膚，用眼科剪沿腹中線，依次剪開表層皮膚和內(nèi)層皮膚。用干棉簽撥動(dòng)肝左葉，徹底暴露肝左葉，然后拿著帶有蟲子的1 mL注射器，倒置然后待頭節(jié)沉積于針頭附近，平放在操作臺(tái)上。左手手持棉簽抵住肝左葉使其形成一個(gè)平面，右手手持注射器針頭平肝被膜穿刺然后沿著被膜深入約0.5 cm，推動(dòng)注射器活塞，肝臟被膜白色凸起，棉簽壓住進(jìn)針處，拔針，棉簽繼續(xù)按壓10 s。使用持針器單純連續(xù)縫合內(nèi)層皮膚和外層皮膚，最后用棉簽擦除血漬，待其蘇醒。

1.6 HE染色

蘇木素染液為堿性染料，主要使細(xì)胞核和核糖體染色成紫藍(lán)色，伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色，伊紅染色液中加入0.2%的冰醋酸。4%多聚甲醛固定24 h后的肝臟組織，石蠟包埋，然后切片4 μm，經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水之后，蘇木素和伊紅染色，脫水，透明，封片顯微鏡觀察。

1.7 天狼星紅染色

4 μm厚的石蠟切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水之后，天狼星紅飽和苦味酸染色1 h，然后蘇木素染色，脫水，透明，封片，顯微鏡拍照系統(tǒng)采樣。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)活性的測(cè)定

在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)，細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)未被伊紅染色為活性較好的頭節(jié)(圖1A)，而有些蟲子吸盤部分被紅染是活性較好的頭節(jié)(圖1B)，而著色為深紅色的頭節(jié)是已經(jīng)凋亡的頭節(jié)(圖1B、圖1C)。

圖1 3個(gè)不同視野下細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)伊紅染色(40×)

2.2 細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)感染肝臟的形態(tài)學(xué)觀察

肝臟的形態(tài)學(xué)，細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)感染小鼠肝臟30 d時(shí)，3 000頭節(jié)組有乳白色囊泡形成且稍有凸起，而5000頭節(jié)組乳白色囊泡凸起并向周圍擴(kuò)散。感染后60 d，3 000頭節(jié)組，小白泡在擴(kuò)大且凸起，而5 000頭節(jié)組囊泡進(jìn)一步擴(kuò)大和凸起，并且在周圍可以看到有透光性增加的囊泡形成。感染后90 d，3 000頭節(jié)組和5 000頭節(jié)組的囊泡大部分趨于透明，并且5 000頭節(jié)組比3 000頭節(jié)組囊泡更多。感染后120 d和150 d，囊泡的數(shù)量增多同時(shí)體積也增大，5 000頭節(jié)組比3 000頭節(jié)組更明顯(圖2)。這些反應(yīng)了細(xì)粒棘球蚴感染的嚴(yán)重程度跟注射的頭節(jié)數(shù)量有關(guān)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，感染的病灶向周圍擴(kuò)散，呈遷延、進(jìn)展性疾病，為后續(xù)疾病不同的發(fā)展的階段提供了研究基礎(chǔ)。

圖2 細(xì)粒棘球蚴感染后的小鼠肝臟

2.3 HE切片觀察

HE的結(jié)果顯示造模30 d，3 000頭節(jié)和5 000頭節(jié)感染的小鼠，感染灶大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴嗜酸性粒細(xì)胞。感染后60 d，淋巴細(xì)胞在病灶浸潤(rùn)程度減輕，囊周有嗜酸性細(xì)胞的存在。90 d可以看到有多核巨、異物巨細(xì)胞以及上皮樣細(xì)胞的存在。120 d和150 d囊周淋巴細(xì)胞減少，上皮樣細(xì)胞緊密排列伴角質(zhì)層的存在，且病灶周圍的肝臟組織有大量的紅細(xì)胞(圖3)。

HE染色結(jié)果提示細(xì)粒棘球蚴感染肝臟的炎癥反應(yīng)程度呈下降的趨勢(shì)，且感染120 d后有組織淤血的表現(xiàn)。

圖3 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟后HE染色(40×)

2.4 天狼猩紅染色

3 000頭節(jié)組和5 000頭節(jié)組在感染30 d時(shí)，天狼星紅染色顯示有疏松的纖維組織形成，60 d纖維組織增多并且有致密化的趨勢(shì)，而在90 d有一層致密的纖維組織形成，而到了120 d有多層的致密的纖維組織形成，150 d纖維組織增厚且致密化(圖4)。

這些提示細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟過程中，纖維組織增多并且向致密化發(fā)展，提示肝臟抗纖維化的治療也是包蟲病的治療的重要方面。

圖4 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟后天狼星紅染色(40×)

3 討論

全球估計(jì)有120萬(wàn)人受到細(xì)粒棘球蚴感染的影響，對(duì)人類的生命健康和財(cái)產(chǎn)安全帶來(lái)了威脅[9]，因此研究細(xì)粒棘球蚴感染肝臟的研究顯得十分重要。包蟲囊泡向外由無(wú)細(xì)胞的角質(zhì)層組成，這些角質(zhì)層產(chǎn)生育囊和原頭蚴(PSC)[10]。角質(zhì)層由高度糖基化的糖蛋白網(wǎng)組成，在中間宿主的間胚層的免疫逃逸中起關(guān)鍵作用[11]。本實(shí)驗(yàn)中可以看到淋巴細(xì)胞在30 d大量細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞減少，上皮樣細(xì)胞和多核巨增多，炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)，在感染后120 d和150 d角質(zhì)層形成，可能與文獻(xiàn)[9-11]描述的一致，角質(zhì)層與免疫逃逸相關(guān)。

細(xì)粒棘球蚴感染過程中，由于炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化的發(fā)展，導(dǎo)致肝臟構(gòu)架的嚴(yán)重破，肝包蟲病的囊性形式，在肝臟中形成寄生蟲肉芽腫和在囊腫中發(fā)生不可逆的纖維化有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠肝臟組織天狼星紅染色顯示細(xì)粒棘球蚴感染過程中，囊周的纖維組織由疏松到致密，纖維組織的量呈持續(xù)性增加，與臨床符合，為后續(xù)肝包蟲病相關(guān)纖維化的研究，提供了研究基礎(chǔ)

細(xì)粒棘球蚴感染模型主要集中在腹腔接種或者肝臟注射。Labsi M等[12]通過在C57小鼠腹腔接種2000頭節(jié)，感染3個(gè)月后可以在肝臟看到非常少量的囊泡，囊泡定位于肝臟，且繼發(fā)性感染至肝臟的成功率為67%。Patricia E等[13]通過腹腔給與1500頭節(jié)，5個(gè)月后然后用藥物治療，觀察囊泡情況，而本實(shí)驗(yàn)中，通過在肝臟注射細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)3個(gè)月之后，可以看到囊泡已經(jīng)浸潤(rùn)肝葉大部分，形成囊泡，這樣用藥更能符合細(xì)粒棘球蚴寄居宿主部位，更貼近臨床實(shí)際情況，具有更好的臨床參考價(jià)值。腹腔接種限制了對(duì)肝臟包蟲的研究，感染后對(duì)淋巴細(xì)胞的影響不足以準(zhǔn)確反映細(xì)粒棘球蚴感染對(duì)肝臟的影響。

其他研究對(duì)肝臟直接注射細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)，稍有欠缺。葉建蔚等[14]注射細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)到小鼠的肝臟，他們觀察周期為6個(gè)月，對(duì)造模過程的描述不盡詳細(xì)，并且感染的周期較長(zhǎng)和感染率較低。王慧等[15]通過體外培養(yǎng)60 d形成微囊，然后種植在肝臟，雖然成功率比較高，但是長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)體外培養(yǎng)容易污染，限制了后續(xù)的研究。

前期本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的肝臟注射1000/2000頭節(jié)組，造模40只，只有極個(gè)別成功建立繼發(fā)性感染模型，成功率僅為10%。后期，通過改進(jìn)注射方法，將頭節(jié)的注射量提升到3000/5000頭節(jié)，感染造模成功率達(dá)到90%以上且小鼠存活率符合造模的要求，為后續(xù)進(jìn)一步研究細(xì)粒棘球蚴的感染提供了研究基礎(chǔ)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從肝臟組織形態(tài)評(píng)價(jià)了細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型的構(gòu)建，并且更高的造模成功率，為肝包蟲病相關(guān)的纖維化以及免疫逃逸機(jī)制的研究提供更好的研究基礎(chǔ)。