王勇，鄭煒，馬忠臣，唐燕，張輝，張麗娟，陳創(chuàng)夫*

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003;2 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所, 北京 102206)

嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophilum，APH)感染引起人粒細(xì)胞無形體病(HGA)，一種蜱傳人獸共患病。嗜吞噬細(xì)胞無形體已進(jìn)化出適應(yīng)宿主細(xì)胞環(huán)境的機(jī)制，在白細(xì)胞(如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)中形成包涵體而存在[1-2]。嗜吞噬細(xì)胞無形體感染常導(dǎo)致宿主細(xì)胞多種生物過程發(fā)生改變?nèi)缂?xì)胞分化與增殖、免疫應(yīng)答、溶酶體融合、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3-4]，然而，嗜吞噬細(xì)胞無形體侵染宿主細(xì)胞的致病機(jī)制仍待深入研究。研究報(bào)道，嗜吞噬細(xì)胞無形體Ats-1蛋白作為病原毒力因子，在調(diào)控病原入侵、胞內(nèi)生存繁殖以及宿主細(xì)胞生物過程等方面起重要作用[5]。Ats-1蛋白是嗜吞噬細(xì)胞無形體四型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白，可定位到受感染細(xì)胞線粒體基質(zhì)中，部分導(dǎo)致抗凋亡效應(yīng)。大部分Ats-1蛋白位于宿主細(xì)胞質(zhì)中，可能參與調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過程，其詳細(xì)的信號(hào)機(jī)制及通路有待進(jìn)一步深入研究[5-6]。

為了解中國人源嗜吞噬細(xì)胞無形體分離株分子致病機(jī)理，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與Ats-1蛋白互作的宿主細(xì)胞靶蛋白，并分析了宿主細(xì)胞靶蛋白在病原感染過程中可能發(fā)揮的調(diào)控作用，為深入了解嗜吞噬細(xì)胞無形體分子致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒

2009—2010年間于中國山東萊州灣地區(qū)無形體病人分離到的2株人源致病菌(LZ-HGA-agent-3和LZ-HGA-agent-4)，以及從長角血蜱(H.longicornis)分離到的1株蜱源無形體分離株(LZ-HGA-agent-T1)，3株中國無形體分離株通過HL60細(xì)胞培養(yǎng)并由本室保藏[7-8]。大腸桿菌DH5α由本室保存，大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，釀酒酵母菌株Y2HGold和Y187、質(zhì)粒pGBKT7 DNA-BD、pGADT7-Rec、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均購自Clontech公司，人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑

DNeasy?Blood & Tissue kit、RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司，YeastmakerTMYeast Transformation System 2、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System，營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal(QDO/X)均購自Clontech公司，X-α-Gal購自生工生物工程(上海)股份有限公司，NdeⅠ/BamHⅠ購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的A.phagocytophilumHZ株ats-1基因(FJ210653) 序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增ats-1基因引物，并在上、下游引物上分別加上NdeⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2ats-1序列PCR擴(kuò)增、測(cè)序及分析

將測(cè)序并人工校對(duì)過的ats-1基因序列輸入到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/中的nucleotide blast 程序中進(jìn)行序列比對(duì)分析。DNASTAR Lasergene v7.1.0程序包中的EditSeq程序?qū)ts-1基因序列及其氨基酸序列進(jìn)行編輯修飾、MegAlign程序?qū)ts-1基因序列及氨基酸序列序列與國際參考株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析。由于ats-1基因核酸水平及其所編碼氨基酸水平與嗜吞噬細(xì)胞無形體HZ株ats-1差異不明顯，故僅分析其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)信息。用Galaxy TBM(http://galaxy.seoklab.org/)分析Ats-1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用String(https://string-db.org/) 在線程序分析Ats-1蛋白細(xì)菌內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖(confidence設(shè)為0.7，其它參數(shù)設(shè)為默認(rèn))。

1.2.3 誘餌載體構(gòu)建及其自激活、毒性檢測(cè)

空載體pGBKT7 DNA-BD、重組質(zhì)粒pEASY-ats-1經(jīng)過NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切后，回收的pGBKT7大片段、ats-1進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，最后涂布LB/Kan+平板，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序分析鑒定陽性重組質(zhì)粒pGBKT7-ats-1轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，步驟參考YeastmakerTMYeast Transformation System 2說明書。酵母轉(zhuǎn)化子涂布于SD/-Trp/Kan+平板培養(yǎng)后經(jīng)PCR及測(cè)序方鑒定陽性重組質(zhì)粒。釀酒酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)涂布SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板30 ℃培養(yǎng)4～5 d，觀察菌落生長及顏色等判斷是否有自激活作用；從SD/-Trp平板上挑選最大菌落接種SD/-Trp/Kan+液體培養(yǎng)基30 ℃，250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)(16～24 h)，測(cè)培養(yǎng)物的OD600值，判斷是否有毒性。以Y2HGold(pGBKT7 DNA-BD)為試驗(yàn)對(duì)照。

1.2.4 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)cDNA文庫的構(gòu)建及分析

用RNeasy Mini Kit抽提THP-1細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA純度及濃度。利用Clontech公司Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System進(jìn)行cDNA合成及純化。根據(jù)YeastmakerTMYeast Transformation System 2說明書進(jìn)行pGADT7-Rec和cDNA共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，酵母轉(zhuǎn)化液涂布SD/-Leu平板；同時(shí)轉(zhuǎn)化pGADT7-Rec、pGADT7-Rec+SV40 large T至Y187做為陰、陽性對(duì)照，對(duì)照轉(zhuǎn)化酵母菌涂布SD/-Leu平板；所有轉(zhuǎn)化酵母菌于30 ℃培養(yǎng)3～5 d。收集SD/-Leu平板上Y187酵母轉(zhuǎn)化子，-70 ℃凍存cDNA文庫。取適量Y187(pGADT7-cDNA)凍存液涂布SD/-Leu平板培養(yǎng)并觀察是否有雜菌生長。Y187(pGADT7-cDNA)凍存液按10-2，10-3，10-4比例稀釋后分別涂布于SD/-Leu平板培養(yǎng)并計(jì)算SD/-Leu板上菌落數(shù)及庫容量。提取Y187(pGADT7-cDNA)凍存液酵母質(zhì)粒pGADT7-cDNA并轉(zhuǎn)化Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增、電泳分析，評(píng)估cDNA文庫插入片段長度。

1.2.5 Ats-1蛋白與THP-1細(xì)胞互作靶蛋白篩選及生物信息分析

構(gòu)建的Y2HGold(pGBKT7-ats-1)與Y187(pGADT7-cDNA)進(jìn)行酵母雙雜交，同時(shí)做陽性對(duì)照(Y2HGold [pGBKT7-53]×Y187 [pGADT7-T])、陰性對(duì)照(Y2HGold [pGBKT7-Lam]×Y187 [pGADT7-T])，操作按MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System說明書進(jìn)行。酵母菌液分別涂布于DDO、QDO、QDO/X培養(yǎng)基平板篩選陽性克隆子，通過PCR擴(kuò)增、測(cè)序確定捕獲靶蛋白基因，通過在線程序https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi、http://www.ebi.ac.uk/對(duì)捕獲靶蛋白進(jìn)行GO生物信息分析。利用String(https://string-db.org/) 在線程序分析捕獲蛋白宿主胞內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖(confidence設(shè)為0.9，其它參數(shù)設(shè)為默認(rèn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 ats-1 PCR擴(kuò)增及序列生物信息分析結(jié)果

A.phagocytophilumLZ-HGA-Agentats-1基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析獲得885 bp預(yù)期長度片斷(圖1)。ats-1序列與國際參考株A.phagocytophilumHZ株ats-1同源性為99%，僅一個(gè)核酸差異；所編碼氨基酸序列同源性100%。A.phagocytophilumLZ-HGA-Agent Ats-1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)。Ats-1蛋白嗜吞噬無形體內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。Ats-1可能與VirD4、AnkA、AmpA、APH_0032和 APH_0860互作。

1-4—目的基因ats-1; 5—陽性對(duì)照; 6—陰性對(duì)照; M—DNA Marker 2 000圖1 目的基因ats-1的PCR擴(kuò)增

圖2 Ats-1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 Ats-1蛋白質(zhì)無形體內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)自激活、毒性檢測(cè)

涂布Y2HGold(pGBKT7-ats-1)的SD/-Trp平板、SD/-Trp/X-α-Gal平板上均有菌落長出且直徑大于2 mm，而SD/-Trp/X-α-Gal平板上菌落不變藍(lán)。證明釀酒酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)無自激活作用。

震蕩培養(yǎng)24 h后的酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)菌液的OD600值均大于1.0(>0.8即判定為無毒性)，而且與Y2HGold(pGBKT7 DNA-BD)菌液相比，生長情況基本一致。證明酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)無毒性。

2.3 THP-1 cDNA文庫評(píng)價(jià)

2.3.1 Y187(pGADT7-cDNA)文庫克隆數(shù)、轉(zhuǎn)化效率及污染檢測(cè)

150 μL 10-2稀釋菌液涂布SD/-Leu平板，平均每個(gè)平板克隆數(shù)為400，則15 mL重懸液克隆數(shù)(庫容量)=(400÷0.15)×100×15=4×106個(gè)克隆。轉(zhuǎn)化效率=(400×15)÷(0.15×3.94)×100=1.02×106cfu/μg。涂布Y187(pGADT7-cDNA)凍存液的SD/-Leu平板上沒有出現(xiàn)污染物。

2.3.2 cDNA文庫插入片段評(píng)價(jià)

共挑取51個(gè)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中49個(gè)菌落擴(kuò)增到條帶，2個(gè)菌落未擴(kuò)增到條帶，部分菌落PCR結(jié)果見圖2；PCR分析證實(shí)cDNA文庫插入片段在100～3 000 bp之間，片段主要集中于500～2 000 bp間(圖4)。由菌落PCR推算得知重組率為(51-2)/51=96.1%。

注：M為DNA Marker 5 000; 1-45為cDNA 插入片段; 46為陰性對(duì)照?qǐng)D4 PCR鑒定cDNA文庫插入片段大小

2.4 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)及分析

釀酒酵母菌株Y2HGold(pGBKT7-ats-1)與Y187(pGADT7-cDNA)經(jīng)雜交后，在QDO平板上長出單菌落。再將這些菌落轉(zhuǎn)接到QDO/X平板上，部分菌落變藍(lán)(圖5)。

圖5 Y2HGold(pGBKT7-ats-1)與Y187(pGADT7-cDNA)雜交結(jié)果

2.5 Ats-1蛋白與THP-1細(xì)胞互作潛蛋白鑒定與分析

與Ats-1蛋白互作的捕獲蛋白基因PCR產(chǎn)物測(cè)序、Blastn及http://www.ebi.ac.uk/等分析，7個(gè)陽性捕獲靶蛋白生物信息分析結(jié)果見表1，由此可知，捕獲的宿主靶蛋白主要參與細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞凋亡、自噬、炎癥等生物學(xué)過程。捕獲蛋白宿主胞內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)，由此可知，ZFP36L2可能與ZDHHC9-GOLGA7復(fù)合物互作；LGALS1主要與凝血因子F5、纖維蛋白原FGG和FGA、IL-6、TIMP1、載脂蛋白APOA1、GTPase HRAS等互作；TIMP1主要與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14)、白介素IL-6和IL-10、血小板反應(yīng)蛋白THBS1以及轉(zhuǎn)生長因子TGFB1等互作；EEF1A1主要與真核細(xì)胞核糖體蛋白、翻譯延伸因子1復(fù)合體互作;PTMA與副甲狀腺素PTMS互作;ATRN與E3泛素化蛋白連接酶MGRN1互作。

表1 THP-1細(xì)胞捕獲靶蛋白及其生物信息分析

注：A、B、C、D、E、F分別代表捕獲蛋白ZFP36L2、LGALS1、TIMP1、EEF1A1、PTMA、ATRN在宿主胞內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖圖6 捕獲蛋白宿主胞內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

人粒細(xì)胞無形體病(HGA)癥狀主要是發(fā)熱、肌痛、頭痛、血小板減少、白細(xì)胞減少、貧血，以及輕、中度肝損傷導(dǎo)致血清中天冬氨酸、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性升高，病癥嚴(yán)重度從無癥狀到死亡不等[4]；同時(shí)伴隨有嚴(yán)重并發(fā)癥包括膿毒性休克樣綜合征(SSLS)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和機(jī)會(huì)感染。HGA病例中，36%需住院治療，7%需重癥監(jiān)護(hù)(ICU)，0.6%死亡。因此，探究該病的發(fā)病機(jī)理，特別是分子致病機(jī)理，對(duì)防控和治療該病至關(guān)重要[9]。

本研究為了探討嗜吞噬細(xì)胞無形體(APH)致病機(jī)理，從三個(gè)水平—細(xì)菌水平、宿主細(xì)胞水平以及細(xì)菌-宿主互作水平—開展實(shí)驗(yàn)及生物信息學(xué)研究。

在細(xì)菌水平上，我們利用生物信息學(xué)方法分析了嗜吞噬細(xì)胞無形體分泌蛋白Ats-1在細(xì)菌胞內(nèi)可能的互作網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。已有文獻(xiàn)通過細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)(利用APH的VirD4為誘餌與APH基因組為prey文庫進(jìn)行雜交)篩選到一個(gè)假定蛋白(命名無形體易位底物1，Ats-1)[5]，因此可知分泌蛋白Ats-1是四型分泌系統(tǒng)(T4SS)的一個(gè)底物，可以與T4SS的組分VirD4相互作用，本研究中生物信息學(xué)分析結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。串聯(lián)重復(fù)序列的酸性蛋白，APH_0032，分泌后定位在囊泡內(nèi)的APH表面及包涵體膜的基質(zhì)側(cè)膜上[10],該蛋白膜定位作用表明：它在包涵體膜生物發(fā)生過程中起作用，這一生物發(fā)生過程還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。分泌的效應(yīng)蛋白AmpA 可以劫持宿主細(xì)胞泛素化作用，調(diào)節(jié)病原菌胞內(nèi)感染，有利于病原菌胞內(nèi)生存[11]。

嗜吞噬細(xì)胞無形體(APH)擾亂破壞機(jī)體防御細(xì)胞(如人粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)可能導(dǎo)致人類疾病發(fā)生[1]。盡管宿主免疫細(xì)胞可通過多種機(jī)制如活性氧產(chǎn)生、抗菌肽和酶的分泌等機(jī)制作用并清除病原菌[9]，但APH依然能在這些細(xì)胞中生存繁殖，其分子致病機(jī)理仍待深入研究。因此，細(xì)菌-宿主互作水平上，本研究選用中國人源APH分離株LZ-HGA-Agent Ats-1蛋白和人單核細(xì)胞THP-1為研究重點(diǎn)，通過酵母雙雜交篩選到與Ats-1蛋白互作的THP-1細(xì)胞靶蛋白7個(gè)，生物信息分析顯示，這些靶蛋白主要與宿主細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡、自噬、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等若干生物學(xué)過程有關(guān)(表1)。

在宿主細(xì)胞水平上，我們利用生物信息學(xué)方法分析了部分宿主細(xì)胞捕獲蛋白在胞內(nèi)的生物學(xué)過程(表1)以及可能的互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

HGA病人感染后出現(xiàn)貧血、白細(xì)胞減少、血小板減少等癥狀，但其發(fā)生原因不清楚[4]。Zhang[12]研究證實(shí)，經(jīng)刺激物刺激可促使紅細(xì)胞鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，ZFP36L2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到早期紅系祖細(xì)胞的mRNA上,促使早期紅系祖細(xì)胞更多地進(jìn)行細(xì)胞分裂，最終形成更多的晚期紅系祖細(xì)胞，進(jìn)而能增加紅細(xì)胞數(shù)量。從胞內(nèi)互作網(wǎng)絡(luò)圖3 A，可知ZFP36L2可能與ZDHHC9-GOLGA7復(fù)合物互作。ZDHHC9-GOLGA7復(fù)合物是一個(gè)棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，主要跟 HRAS和NRAS運(yùn)輸有關(guān)，HRAS和NRAS蛋白是RAS/MAPK信號(hào)通路的組分，可以將胞外信號(hào)傳遞到胞核，指導(dǎo)細(xì)胞增殖、成熟和分化，如果該通路受影響可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少。本研究分析推測(cè)，中國APH分離株蛋白Ats-1可能與宿主細(xì)胞蛋白ZFP36L2、EEF1A1發(fā)生作用，引起HGA病人出現(xiàn)貧血癥、白血球減少癥。

半乳糖凝集素1(LGALS1)通過與多種細(xì)胞分子互作，可調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)互作，參與多種細(xì)胞生理、病理過程如黏附、增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等[13](圖3B)。在免疫反應(yīng)中，LGALS1調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的功能，還可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡并具有抗炎功能，可抑制病原感染[13]。Belyi[14]研究發(fā)現(xiàn)EEF1A的GTPase結(jié)構(gòu)域Ser53糖基化，可抑制真核宿主細(xì)胞蛋白合成以及細(xì)胞死亡。另外，EEF1A1還可以與真核細(xì)胞核糖體蛋白、翻譯延伸因子1復(fù)合體互作，影響蛋白質(zhì)翻譯(圖3D)。Jiang[15]研究發(fā)現(xiàn)PTMA通過抑制凋亡小體形成進(jìn)而負(fù)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的caspase-9活性。PTMS還可以抑制PTMA的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而可以抵抗細(xì)菌感染(圖3E)。據(jù)此分析，中國APH分離株蛋白Ats-1與LGALS1、EEF1A、PTMA發(fā)生作用，可能影響了宿主細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，從而導(dǎo)致病原逃逸宿主細(xì)胞的殺傷作用。

由圖3C可知，人金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP1)主要與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14)、白介素IL-6和IL-10、血小板反應(yīng)蛋白THBS1以及轉(zhuǎn)生長因子TGFB1等互作。TIMP1屬于TIMP家族，該家族所編碼蛋白是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs胞外基質(zhì)降解相關(guān)的一組肽酶)的天然抑制劑，有促細(xì)胞生長、抗細(xì)胞凋亡功能。TIMP1可以激活酪氨酸/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，從而調(diào)控細(xì)胞生長與分化、炎癥與細(xì)胞凋亡等[16]。由此推測(cè)中國APH分離株蛋白Ats-1與TIMP1作用，可能阻礙TIMP1功能發(fā)揮，從而使宿主細(xì)胞生長受抑，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少。另外TIMP1可影響缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路，繼而影響氧環(huán)境穩(wěn)定性[17-18]。本研究分析：中國APH分離株侵襲機(jī)體后，造成機(jī)體病灶區(qū)氧含量低于正常值，由于病原Ats-1與HIF-1互作，影響了HIF-1蛋白功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致機(jī)體病灶區(qū)氧含量無法恢復(fù)正常值，有氧殺傷系統(tǒng)效能降低，從而有利于病原菌胞內(nèi)生存。

總之，APH分子致病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，病原分子致病機(jī)理的詳細(xì)研究有利于從分子水平上解釋HGA病因。本研究從分子水平分析了蛋白-蛋白互作對(duì)病原菌分子致病機(jī)理、疾病病因的發(fā)生以及臨床表現(xiàn)的可能影響。鑒于酵母雙雜交技術(shù)的局限性，目前本研究小組正在進(jìn)一步驗(yàn)證Ats-1與靶蛋白互作，研究蛋白-蛋白互作對(duì)信號(hào)通路的影響，進(jìn)而為揭示HGA發(fā)病機(jī)理/病原分子致病機(jī)理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。