張苗，張潔，代斌

(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003)

香蕉(MusananaLour.)是芭蕉科芭蕉屬植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，且活性價(jià)值高，果皮也被廣泛用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療口腔炎癥和促進(jìn)腸蠕動(dòng)[1]。香蕉皮占全果重量的30%～40%左右[2]，因其中含有大量的維生素和礦物質(zhì)，已被作為化妝品的生產(chǎn)原料；此外，香蕉皮還含有豐富的植物多酚類化學(xué)物質(zhì)[3]，具有獨(dú)特的抗衰、抗氧化、修復(fù)氧化細(xì)胞以及保護(hù)細(xì)胞不被損傷的功效[4]。植物多酚可通過(guò)抗氧化而防止肝臟病變[5]，存在于茶和石榴中的多酚已被證明可以保護(hù)肝臟免受酒精相關(guān)的損害[6]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)香蕉皮多酚的提取已有一些研究[7-9]，但存在提取成本高、耗能、時(shí)間長(zhǎng)效率低、難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等各種缺陷。近幾年發(fā)展的高剪切法是可以輔助溶劑提取的新技術(shù)，其極高的剪切速度和高頻的機(jī)械效應(yīng)可以強(qiáng)化溶解、分散、混合、萃取等過(guò)程，提取中可使細(xì)胞壁快速破損，有效組分在極性相似的溶劑作用下很快溶出，從而高效獲得香蕉皮中的有效組分。高剪切具有普通提取方法無(wú)法達(dá)到的提取效果，尤其適用于天然物質(zhì)的植物活性成分，同時(shí)，高剪切具有操作簡(jiǎn)單、耗能低、原料使用量少和組分提取時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)，比溶劑連續(xù)提取、微波、超聲等方法的效率大幅提高[10-14]。研究[15-17]表明，高剪切法不僅可以提高有效組分的得率、節(jié)省提取時(shí)間，還能保持活性組分的生物活性。

由上述研究可知高剪切是一種簡(jiǎn)單、快速、綠色、高效的天然產(chǎn)物提取方法，因此，利用高剪切提取的諸多優(yōu)勢(shì)，本文實(shí)驗(yàn)通過(guò)高剪切輔助乙醇溶劑提取香蕉皮中的總多酚，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)考察料液比、乙醇溶劑的濃度、高剪切實(shí)驗(yàn)設(shè)備的參數(shù)等對(duì)香蕉皮凍果中總多酚提取得率的影響，確定較優(yōu)參數(shù)范圍，然后借助響應(yīng)面法(RSM)[18-19]對(duì)實(shí)驗(yàn)工藝進(jìn)行分析和優(yōu)化，以期得到香蕉皮凍果中總多酚提取的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 原料

購(gòu)買顏色亮麗、無(wú)破損、無(wú)氧化的新鮮香蕉，取香蕉皮，熱燙鈍化多酚氧化酶[20]，40 ℃烘至香蕉皮質(zhì)量不再改變，剪碎成小粒，冷凍保存。

1.2 儀器與試劑

采用儀器如下：FA25型弗魯克間歇式高剪切分散乳化機(jī)(上海Fluko科技發(fā)展有限公司)、AL04萬(wàn)分之一精密天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、Bioridge RG-160AT離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、OSB-2200恒溫反應(yīng)槽(東京理化器械株式會(huì)社)、Cintra 20紫外-可見分光光度計(jì)(澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司)。

采用試劑如下：沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(Alfa-Esa(中國(guó))化學(xué)有限公司)、福林-酚(Folin-Ciocalteu)試劑(TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、無(wú)水乙醇等其余分析純?cè)噭?上海Admas-Beta試劑有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉皮多酚的提取

稱取適量解凍的香蕉皮放置于廣口剪切瓶中，緩慢加入乙醇溶液140 mL，將上述溶液高剪切一定時(shí)間后靜置，待其雜質(zhì)沉淀后，取上層清液置于離心機(jī)中10 000 r/min離心3 min后得到樣品。

1.3.2 香蕉皮多酚含量的檢測(cè)

(1)溶液的配制。精確稱量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，將其置于500 mL容量瓶中后加入適量蒸餾水溶解，振搖混勻后定容至刻度，配制為100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液備用；再稱取干燥的無(wú)水碳酸鈉固體50 g，加去離子水適量，定容至500 mL容量瓶，配制為10%的碳酸鈉溶液，備用。

(2)福林-酚法測(cè)定條件的確定。精確量取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，稀釋100倍，分別考察Folin-Ciocalteu用量、碳酸鈉與Folin-Ciocalteu用量比、最大吸收波長(zhǎng)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，由此確定適合香蕉皮多酚的檢測(cè)條件，其中測(cè)量液體∶Folin-Ciocalteu∶10%碳酸鈉溶液體積比為1∶4 ∶16，測(cè)定條件為40 ℃恒溫，反應(yīng)時(shí)間30 min，測(cè)量波長(zhǎng)760 nm。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別向10 mL比色管中移取體積為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸溶液，依次加入Folin-Ciocalteu試劑0.4 mL、10%碳酸鈉溶液1.6 mL后定容，于40 ℃的恒溫槽中遮光反應(yīng)30 min，取出放至室溫，于760 nm測(cè)定吸光度值，以均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程如下：

y=0.123 1x+0.003 7，R2=0.999 7。

圖1 沒(méi)食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

(4)測(cè)定多酚含量。移取0.1 mL香蕉皮多酚提取物，以確定的Folin-Ciocalteu法檢測(cè)條件，測(cè)量吸光度，香蕉皮凍果中總多酚的得率由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到，多酚得率的計(jì)算公式如下：

(1)

式(1)中，M為總多酚的得率(mg/g，GAE/Fw)，以標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸計(jì)算，y是樣品提取物的吸光度值；V為溶劑體積(mL)，m為香蕉凍果皮的質(zhì)量(g)。

1.3.3 高剪切提取單因素試驗(yàn)

采用高剪切輔助乙醇法提取香蕉皮多酚，通過(guò)試驗(yàn)考察4個(gè)單因素對(duì)香蕉皮多酚得率的影響，4個(gè)因素分別為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、剪切轉(zhuǎn)速和剪切時(shí)間。不同因素設(shè)定不同水平，通過(guò)試驗(yàn)確定不同因素的較優(yōu)范圍。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

為了優(yōu)化多酚的提取條件，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以香蕉皮總多酚的提取含量為指標(biāo)和響應(yīng)值，采用以上4個(gè)因素設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比的影響

分別稱取解凍后的香蕉皮28、14、7、4.67、3.5 g于剪切瓶中，加入140 mL乙醇溶液(40%)，分別對(duì)應(yīng)液料比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，以13 000 r/min的剪切轉(zhuǎn)速，高速剪切3 min后靜置，待分層澄清后取上層清液，于離心機(jī)中以10 000 r/min的速度離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法最優(yōu)反應(yīng)及測(cè)試條件測(cè)定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計(jì)算得到，液料比的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比的影響

由圖2可以看出：物料多對(duì)香蕉皮多酚的提取不利。其原因是，由于物料量越大，溶劑粘度也隨之大，物料得不到充分的剪切，同時(shí)還會(huì)發(fā)生空轉(zhuǎn)現(xiàn)象，不斷增大實(shí)驗(yàn)的溶劑量會(huì)造成植物總多酚產(chǎn)量增多。液料比為20∶1時(shí)，香蕉皮凍果中總多酚的得率為5.43 mg/g，達(dá)到峰值，當(dāng)繼續(xù)增大溶劑量時(shí)，植物總多酚的得率開始減小。由此可知，最佳液料比為20∶1。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

稱取6份解凍的香蕉皮，每份7 g，加入剪切瓶中，固定液料比20∶1，分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液140 mL，以剪切轉(zhuǎn)速13 000 r/min高速剪切3 min后靜置，待固液分層澄清后取上層清液，于離心機(jī)中以10 000 r/min離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測(cè)試條件測(cè)定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計(jì)算得到，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：香蕉皮凍果中提取出的多酚與乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)有關(guān)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，香蕉皮中提取出的多酚達(dá)到最大值5.48 mg/g，增加或者降低這一乙醇濃度時(shí)香蕉皮多酚的得率都明顯下降。香蕉皮中多酚類物質(zhì)的極性更接近于40%的乙醇極性，因此在該濃度下多酚能夠大量溶出，所以乙醇濃度選擇40%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 高剪切轉(zhuǎn)速的影響

分別稱取解凍的香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，根據(jù)高剪切分散乳化機(jī)的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定速度為10 000、13 000、16 000、19 000、22 000 r/min，高速剪切3 min后靜置，待固液分層澄清后取上層清液，于離心機(jī)中以10 000 r/min速度離心3 min后獲得總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測(cè)試條件測(cè)定提取液的吸光度值，多酚得率由式(1)計(jì)算得到，結(jié)果如圖4所示。

圖4 高剪切轉(zhuǎn)速的影響

由圖4可知：高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min時(shí)，總多酚提取量最多，達(dá)到5.68 mg/g；起初隨著剪切轉(zhuǎn)速的增加，香蕉皮凍果中提取的總多酚含量明顯提高，在達(dá)到最大值后隨著剪切速度的遞增，凍果中總多酚得率顯著降低，這可能是因?yàn)榧羟辛Φ脑鰪?qiáng)，使得溶液溫度升高加速多酚類物質(zhì)氧化。因此剪切轉(zhuǎn)速設(shè)為16 000 r/min。

2.1.4 剪切時(shí)間的影響

分別稱取解凍后香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，剪切轉(zhuǎn)速設(shè)為16 000 r/min，分別剪切1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 min，均質(zhì)化完成后，使溶液靜置，離心后得到總多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反應(yīng)及測(cè)試條件測(cè)定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)計(jì)算得到，結(jié)果見圖5。

圖5 剪切時(shí)間的影響

圖5顯示：隨著剪切時(shí)間的增加香蕉皮凍果中總多酚提取量隨之增加，不間斷剪切3 min時(shí)總多酚的得率達(dá)到最大值5.70 mg/g，延長(zhǎng)剪切時(shí)間總多酚提取量降低。一方面高速剪切的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)植物細(xì)胞的破壞力強(qiáng)度越大，另一方面可能是與氧氣接觸的時(shí)間越多，酚類被氧化的幾率也越大，從而使多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，因此將剪切時(shí)間選定為3 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)測(cè)試和結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面法因素水平的選擇

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)香蕉皮凍果中總多酚的提取量設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)方案，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果

以高剪切時(shí)長(zhǎng)(X1)、剪切轉(zhuǎn)速(X2)、液料比(X3)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X4)為自變量，得率(Y)為響應(yīng)值，通過(guò)中心組合試驗(yàn)測(cè)量30個(gè)測(cè)試點(diǎn)，構(gòu)建響應(yīng)面模型，如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面方差分析

通過(guò)軟件分析和方差分析的結(jié)果(表3)可知：P<0.000 1，選用的模型為極顯著；失擬項(xiàng)P>0.05不顯著，表明回歸模型具有較好的擬合性；獲得的測(cè)試值接近預(yù)測(cè)值，各因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系差異系數(shù)R2為 0.981 8，調(diào)整系數(shù)R2為0.963 6，說(shuō)明此模型能夠用來(lái)描述香蕉皮多酚提取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；信噪比為20.853 > 4,說(shuō)明該模型響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，變異系數(shù)為1.38%，表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。

在上述實(shí)驗(yàn)中，X1、X12、X22、X32這4個(gè)因素極為顯著，X2、X3、X1X2這3個(gè)因素較為顯著。

表3 方差分析

2.2.4 響應(yīng)面與等高線

從響應(yīng)面3D圖以及等高線的形狀可直接找出影響實(shí)驗(yàn)值的最直接原因，而且可以直觀描述試驗(yàn)中不同影響因素的強(qiáng)弱效果，并由響應(yīng)面最大值和等高線則能夠判斷出植物多酚提取需要的最優(yōu)工藝。

受不同變量影響及各因素之間相互作用的響應(yīng)面與等高線見圖6。通過(guò)響應(yīng)面分析結(jié)果(圖6)可知：各種因素對(duì)香蕉皮中總多酚得率的影響由大至小依次為高剪切時(shí)長(zhǎng)(X1)、高剪切轉(zhuǎn)速(X2)、料液比(X3)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X4)；經(jīng)優(yōu)化后的最優(yōu)條件是高剪切時(shí)長(zhǎng)2.93 min、高剪切轉(zhuǎn)速16 421.50 r/min、液料比21.17∶1(mL/g)和乙醇體積分?jǐn)?shù)39.27%，預(yù)測(cè)總多酚提取得率為5.81 mg/g。

為了便于實(shí)際操作，最優(yōu)工藝參數(shù)修正為：高剪切時(shí)長(zhǎng)3 min，高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min，液料比20∶1(mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，以此條件經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證，香蕉皮凍果中總多酚得率的平均值為(5.74±0.2)mg/g，接近響應(yīng)面分析的預(yù)測(cè)值，表明該模型準(zhǔn)確、可靠，能較好的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)工藝。

圖6 響應(yīng)面與等高線

3 結(jié)論

(1)本文研究利用高剪切法輔助乙醇提取香蕉皮凍果中總多酚，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化后獲得的最優(yōu)提取方法如下：液料比20∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，高剪切轉(zhuǎn)速16 000 r/min，高剪切時(shí)長(zhǎng)3 min，香蕉皮凍果中總多酚得率的平均值為(5.74±0.2)mg/g。

(2)由高剪切輔助乙醇提取香蕉皮中總多酚耗時(shí)短，提取得率高、設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低，是適合于天然多酚提取的方法。