吳海歌

(大連大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622)

硒是生命活動的必需元素[1]，在人類防癌、抗癌、延緩衰老、提高機體免疫力、預防治療心血管疾病、治療克山病和大骨節(jié)病等方面都發(fā)揮了重要作用[2-4]。硒的存在形式有無機硒和有機硒兩種，常見的無機硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉等，其活性和毒性范圍較窄，生理活性低、毒性大，并具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時劑量難以控制。而有機硒具有毒性低、副作用小的特性，能夠更好地發(fā)揮硒的多種生理活性。有機硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有有機硒的多種活性，而且還具有多糖的各種生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被機體吸收利用[5]。因此，近年來對硒多糖的研究已經成為一個熱點。

1　實驗

1.1　材料與試劑

卡拉膠，江蘇常航膠體科技有限公司；人臍靜脈內皮細胞，ATCC公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，Sigma公司；小牛血清，杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，GibcoBRL公司。

其它試劑均為國產分析純。

1.2　方法

1.2.1硒化卡拉膠寡糖的制備

在酸性條件下，將亞硒酸鈉、硫酸與卡拉膠進行反應；反應結束后，反應液減壓濃縮并通過截留分子量為500的透析袋透析48 h，再經乙醇沉淀、冷凍干燥，得純化的硒化卡拉膠寡糖。設計正交實驗對硒化反應的條件進行優(yōu)化，以提高產物中的硒含量。

1.2.2硒化卡拉膠寡糖硒含量的測定

采用原子吸收法[9]測定硒化卡拉膠寡糖硒含量。稱取50 mg硒化卡拉膠寡糖樣品，用1%HNO3溶解，加入1 mL Ni(OAc)2基體改良劑，然后用1%HNO3定容至10 mL(樣品濃度為5 mg·mL-1)。分別取樣品溶液及標準溶液各2 mL，用原子吸收分光光度計測定樣品溶液的硒濃度。硒化卡拉膠寡糖硒含量為所測樣品溶液的硒濃度/樣品濃度。

1.2.3硒化卡拉膠寡糖的薄層分析(TLC)

對硒化卡拉膠寡糖、乳糖和卡拉膠進行薄層分析，展開劑為正丁醇-乙酸-H2O(體積比為2∶2∶1)。顯色劑為苯胺、二苯胺、磷酸和丙酮。

1.2.4硒化卡拉膠寡糖的紫外光譜分析

將微量的亞硒酸鈉、卡拉膠、卡拉膠寡糖和硒化卡拉膠寡糖溶于水中，在紫外光譜儀上進行測定。

1.2.5硒化卡拉膠寡糖對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

雞胚尿囊膜實驗參照文獻[10]進行。將受精的雞蛋在37 ℃濕潤環(huán)境下孵育6 d，第7 d后用75%的乙醇將雞蛋氣室端消毒后，小心開啟1 cm2的小孔，分別將蘸滿50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖或PBS溶液(陰性對照)的明膠放置在氣孔中的雞胚尿囊膜上，封好小孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在解剖鏡下觀察雞胚尿囊膜血管生成情況。

1.2.6硒化卡拉膠寡糖對人臍靜脈血管內皮細胞遷移的影響

采用劃痕實驗檢測硒化卡拉膠寡糖對血管內皮細胞遷移的影響。首先在培養(yǎng)板中接種2×105個人臍靜脈血管內皮細胞，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細胞長成密集單層后，以0.5 mm的橡皮刮劃過細胞單層，用PBS溶液沖洗2遍，分別加入硒化卡拉膠寡糖和PBS溶液(陰性對照)，硒化卡拉膠寡糖的終濃度分別為50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察人臍靜脈血管內皮細胞遷移的效果。

1.2.7硒化卡拉膠寡糖對人臍靜脈血管內皮細胞分化成管的影響

人臍靜脈血管內皮細胞分化成管實驗參照文獻[11]進行并適當改進。首先將5 mg·mL-1的膠原鋪到96孔板底，在37 ℃下放置20 min后每孔接種2×104個人臍靜脈血管內皮細胞，分別加入PBS溶液(陰性對照)和終濃度分別為50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1的硒化卡拉膠寡糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察人臍靜脈血管內皮細胞成管的狀態(tài)。

2　結果與討論

2.1　硒化卡拉膠寡糖的制備與表征

在酸性條件下，卡拉膠不僅能夠與亞硒酸鈉發(fā)生反應生成硒化卡拉膠，而且能夠通過酸性水解作用最終形成硒化卡拉膠寡糖。純化后的硒化卡拉膠寡糖為粉色粉末狀固體，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。首次制得的硒化卡拉膠寡糖硒含量為21μg·mg-1，經正交實驗優(yōu)化反應條件后制得的硒化卡拉膠寡糖硒含量達到30μg·mg-1，平均分子量為1.43 kDa。

乳糖、硒化卡拉膠寡糖和卡拉膠的薄層層析結果如圖1所示，卡拉膠、卡拉膠寡糖、亞硒酸鈉、硒化卡拉膠寡糖的紫外光譜見圖2。

圖1　乳糖(a)、硒化卡拉膠寡糖(b)、卡拉膠(c)的薄層層析結果

圖2　卡拉膠(a)、卡拉膠寡糖(b)、 亞硒酸鈉(c)、硒化卡拉膠寡糖(d)的紫外光譜

由圖1可以看出，硒化卡拉膠寡糖在硅膠板上的遷移率介于乳糖和卡拉膠之間，并且更接近乳糖，說明制備的產物為寡糖。

由圖2可以看出，卡拉膠和卡拉膠寡糖在190～300 nm都沒有紫外吸收峰，亞硒酸鈉在200～210 nm之間有明顯的吸收峰，硒化卡拉膠寡糖與亞硒酸鈉在相同波長處出現明顯的吸收峰，說明亞硒酸根已經連接到卡拉膠寡糖上，確證產物為硒化卡拉膠寡糖。

2.2　硒化卡拉膠寡糖對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用(圖3)

a.陰性對照b～d.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1):50,100,200

圖3硒化卡拉膠寡糖對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

Fig.3Anti-angiogenicactivityofseleno-carrageenanoligosaccharideonchickenchorioallantoicmembrane

雞胚尿囊膜是檢驗藥物抑制血管生成的經典實驗模型。由圖3a可以看出，雞胚在孵化過程中生出正常的樹枝狀血管；以不同濃度硒化卡拉膠寡糖處理后發(fā)現，硒化卡拉膠寡糖能夠明顯抑制雞胚尿囊膜的血管生成，在施藥部位沒有發(fā)現大的血管生成;50μg·mL-1和100μg·mL-1劑量組施藥部位隱約可見一些微小的血管(圖3b、3c)，而200μg·mL-1劑量組施藥部位沒有發(fā)現微小的血管，表明硒化卡拉膠寡糖在50～200μg·mL-1的濃度范圍內抑制雞胚尿囊膜血管生成作用與濃度正相關。

2.3　硒化卡拉膠寡糖對人臍靜脈血管內皮細胞遷移的影響(圖4)

a.血管內皮細胞劃痕后　b.陰性對照　c～e.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管內皮細胞的遷移是血管生成的關鍵生理步驟之一，抑制血管內皮細胞的遷移是抑制血管生成的有效靶點之一[12]。由圖4b可以看出，人臍靜脈血管內皮細胞的遷移作用很強，24 h后劃痕幾乎愈合；由圖4c、4d、4e可以看出，不同濃度的硒化卡拉膠寡糖能夠抑制血管內皮細胞的遷移，在50～200μg·mL-1濃度范圍內，抑制作用與濃度正相關，濃度越高抑制作用越強。抑制血管內皮細胞的遷移能夠有效地抑制血管的生成，暗示了硒化卡拉膠寡糖能夠通過抑制血管內皮細胞遷移而抑制血管的生成。

2.4　硒化卡拉膠寡糖對人臍靜脈血管內皮細胞分化成管的影響(圖5)

a.陰性對照　b～d.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管內皮細胞分化成管狀結構是決定血管生成的關鍵因素之一，如果血管內皮細胞不能分化為管狀結構，那么新生血管將不能正常形成[12]。由圖5a可以看出，在膠原上三維立體培養(yǎng)可以顯著誘導人臍靜脈血管內皮細胞分化，細胞形成很長的偽足，偽足之間相互聯系形成管狀的結構；由圖5b、5c、5d可以看出，經50μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖處理后，人臍靜脈血管內皮細胞伸出的偽足變少、變短，成管現象減弱；經100μg·mL-1和200μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖處理后，人臍靜脈血管內皮細胞變成長梭形或橢圓形，幾乎看不到較長的偽足。表明硒化卡拉膠寡糖具有抑制人臍靜脈血管內皮細胞分化成管的作用，在50～200μg·mL-1范圍內，抑制作用與濃度正相關，濃度越高抑制作用越強。暗示了硒化卡拉膠寡糖能夠通過抑制血管內皮細胞分化而抑制血管的生成。

3　結論

在酸性條件下，以亞硒酸鈉與卡拉膠反應制備硒化卡拉膠寡糖，硒含量達到30μg·mg-1。雞胚尿囊膜實驗發(fā)現，硒化卡拉膠寡糖具有抑制血管生成作用；人臍靜脈血管內皮劃痕實驗和分化成管實驗發(fā)現，硒化卡拉膠寡糖能夠明顯地抑制人臍靜脈血管內皮細胞的遷移和分化，而且這種抑制作用在50～200μg·mL-1的范圍內與濃度正相關，濃度越高抑制作用越強。暗示硒化卡拉膠寡糖可能是通過抑制血管內皮細胞的遷移和分化從而抑制血管的生成。血管生成對腫瘤的生長和轉移具有重要的作用，抑制腫瘤血管生成可以有效地抑制腫瘤生長和轉移[7-8]，硒化卡拉膠寡糖表現出良好的血管生成抑制作用，預示其在腫瘤血管生成抑制方面具有應用前景。

參考文獻：

[1]BIRRINGER M，PILAWA S，FLOHE L.Trends in selenium bio-chemistry[J].Natural Product Reports,2002,19(6):693-718.

[2]IP C,DONG Y,GANTHER H E.New concepts in selenium chemoprevention[J].Cancer and Metastasis Reviews,2002,21(3):281-289.

[3]XU X M,CARLSON B A,GRIMM T A,et al.Rhesus monkey simian immunod eficiency virus infection as a model for assessing the role of selenium in AIDS[J].Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes,2002,31(5):453-463.

[4]TAN J A,ZHU W Y,WANG W Y,et al.Selenium in soil and endemic diseases in China[J].Science of the Total Environment,2002,284:227-235.

[5]黃峙,鄭文杰,郭寶江.含硒生物大分子化合物研究進展[J].海南大學學報(自然科學版),2001,19(2):169-175.

[6]王長云，顧謙群，周鵬，等.紅藻多糖卡拉膠分子修飾研究Ⅰ.酸降解[J].中國海洋藥物,2003，(2)：24-27.

[7]MACKEY J R,KERBEL R S,GELMON K A,et al.Controlling angiogenesis in breast cancer:A systematic review of anti-angiogenic trials[J].Cancer Treatment Review,2012,38(6):673-688.

[8]NORDEN A D,DRAPPATZ J,WEN P Y.Novel anti-angiogenic therapies for malignant gliomas[J].Lancet Neurol,2008,7(12):1152-1160.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業(yè)出版社，1995：附錄32-33.

[10]ZHAO J,MIAO J Y,ZHAO B X,et al.Safrole oxide inhibits angiogenesis by inducing apoptosis[J].Vascular Pharmacology,2005,43(1):69-74.

[11]JONES M K,WANG H,PESKAR B M,et al.Inhibition of angiogenesis by nonsteroidal anti-inflammatory drugs:Insight into mechanisms and implications for cancer growth and ulcer healing[J].Nature Medicine,1999,5(12):1418-1423.

[12]COULTAS L,CHAWENGSAKSOPHAK K,ROSSANT J.Endothelial cells and VEGF in vascular development[J].Nature,2005,438(7070):937-945.