周廣麒， 劉 雁， 李冬梅， 李秋菊， 劉 沙， 梁玉波

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 116023）

0 引 言

美國(guó)對(duì)貝類帕金蟲（Perkinsus）的研究始于20世紀(jì)40年代，至今世界各國(guó)已普遍認(rèn)為帕金蟲與眾多海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類的大規(guī)模死亡有關(guān)［1－2］。國(guó)際上已經(jīng)公認(rèn)的帕金蟲有7種：包括P.marinus、P.olseni（P.atlantic）、P.qugwadi、P.andrewsi、P.mediterraneus、P.honshuensis 和 P.beihaisens等［3］。這些寄生蟲分別在美洲、澳大利亞、新西蘭、葡萄牙、西班牙、法國(guó)、意大利、韓國(guó)、日本、巴西、中國(guó)等國(guó)家的近海被發(fā)現(xiàn)［4－6］。

20世紀(jì)80年代初以來(lái)，我國(guó)先后引進(jìn)了海灣扇貝、墨西哥灣扇貝、蝦夷扇貝、長(zhǎng)牡蠣、紅鮑、綠鮑、象拔蚌、硬殼蛤、歐洲大扇貝等經(jīng)濟(jì)貝類進(jìn)行養(yǎng)殖。由于多途徑引種，國(guó)外貝類帕金蟲已經(jīng)不可避免地進(jìn)入了我國(guó)海洋生態(tài)系統(tǒng)。梁玉波等檢測(cè)到國(guó)內(nèi)在櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝、菲律賓蛤仔、魁蚶、四角蛤蜊體內(nèi)均有大量的帕金蟲［7］，并確定其為P.olseni（P.atlantic）的新地理亞種［8］，使我國(guó)的帕金蟲研究具有國(guó)際性。

在真核生物基因組編碼核糖體的基因中，18S、5.8S和28SrDNA基因的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由于進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性，真核生物rDNAITS序列在進(jìn)化上具有保守性，對(duì)此序列的檢測(cè)有助于分析其遺傳關(guān)系。帕金蟲的rDNA－ITS序列可以準(zhǔn)確地區(qū)分帕金蟲除P.qugwadi以外的所有種類或發(fā)現(xiàn)未知種［9－10］，序列差異在4%～14%的為不同種帕金蟲，序列差異在0～3%的為不同地理亞種。本文利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，對(duì)我國(guó)沿海從北到南58個(gè)采樣點(diǎn)共30種主要的經(jīng)濟(jì)貝類樣品進(jìn)行rDNA－ITS序列擴(kuò)增，以分析確定我國(guó)貝類體內(nèi)帕金蟲的種類及地域分布。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與固定

對(duì)我國(guó)從南至北海岸線58個(gè)站位點(diǎn)30種經(jīng)濟(jì)貝類進(jìn)行采集，共得到163個(gè)樣品，采集點(diǎn)地理位置和樣品名稱見表1。將采集的樣品置于95%乙醇溶液中進(jìn)行固定［7］。

1.2 基因組DNA的提取

每個(gè)樣品隨機(jī)挑取5個(gè)貝體，用無(wú)菌剪刀取其鰓和消化腺，剪碎、混勻。分別取混勻后的鰓及消化腺各20mg提取基因組DNA。提取方法按DNeasy組織試劑盒（Qiagen）操作手冊(cè)指南進(jìn)行。

1.3 rDNA－ITS的PCR擴(kuò)增與電泳

采用 OIE 公 布 引 物 PerkITS85：5′－CCGCTT－TGT－TTG－GAT－CCC－3′／PerkITS750：5′－ACA－TCA－GGC－CTT－CTA－ATG－ATG－3′，該 引物可以擴(kuò)增所有除P.qugwadi以外的帕金蟲rDNA－ITS序列。

反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液體系（Takara Ex Taq，日 本）；引 物 PerkITS85／PerkITS750 各10pmol；樣品基因組DNA溶液50ng以上。

擴(kuò)增：使用PCR擴(kuò)增儀（ABI9700，美國(guó)），95℃解鏈4min；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃解鏈1min—53℃退火1min—65℃延伸3min；最后65℃繼續(xù)延伸5min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣反應(yīng)，陰性反應(yīng)無(wú)擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照樣擴(kuò)增片段及目的片段大小為660bp左右。

電泳：取8μL PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠用GeneFinder染色，電泳緩沖系統(tǒng)：0.5×TBE［89mmol／L Tris，89mmol／L硼酸，2mmol／L EDTA（pH 8.0）］，于凝膠成像系統(tǒng)（KodakGel2200，美國(guó)）照相。

1.4 rDNA－ITS測(cè)序及分析

將PCR產(chǎn)物測(cè)序（ABI PRISMTM377XL，美國(guó)）。BLAST后，與參考序列進(jìn)行比對(duì)。采用MAGA4軟件建立系統(tǒng)發(fā)生樹，分析親緣關(guān)系。

rDNA－ITS 參 考 序 列 如 下：P.qugwadi AF151528；P.marinus U07700；P.chesapeaki（P.andrewsi）AY876311；P.olseni （P.atlanticus）U07701；P.honshuensis DQ516696；P.olseni DQ516703；P.beihaiensis EF204067；P.mediterraneus EU068099；P.beihaiensis JN054741等。

2 結(jié)果與討論

2.1 rDNA－ITS的PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳結(jié)果見圖1所示（由于樣品數(shù)量多，在此并未給出所有電泳結(jié)果）。由圖1可見，12個(gè)站位的5種經(jīng)濟(jì)貝類共14個(gè)樣品的rDNA－ITS的PCR擴(kuò)增片段大小近700bp，陰性反應(yīng)無(wú)擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)擴(kuò)增片段大小近700bp。擴(kuò)增出片段的樣品包括：福建漳州的菲律賓蛤仔，廣西北海的菲律賓蛤仔、近江牡蠣，海南三亞的近江牡蠣，海南海口的菲律賓蛤仔，廣東湛江的近江牡蠣，廣東陽(yáng)江的近江牡蠣、毛蚶，福建泉州的菲律賓蛤仔，浙江臺(tái)州的菲律賓蛤仔，遼寧金石灘的菲律賓蛤仔，山東萊州的菲律賓蛤仔，河北昌黎的紫貽貝，遼寧龍王塘的皺紋盤鮑。

圖1 樣品的凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the samples

2.2 rDNA－ITS的序列分析及親緣關(guān)系分析

經(jīng)BLAST比對(duì)共得2種rDNA－ITS序列：

福建漳州的菲律賓蛤仔、廣西北海的菲律賓蛤仔、海南海口的菲律賓蛤仔、廣東陽(yáng)江的毛蚶、福建泉州的菲律賓蛤仔、浙江臺(tái)州的菲律賓蛤仔、遼寧金石灘的菲律賓蛤仔、山東萊州的菲律賓蛤仔、河北昌黎的紫貽貝和遼寧龍王塘的皺紋盤鮑的rDNA－ITS序列一致，命名為序列rDNA－ITS－1，其與P.olseni（P.atlantic）在NCBI已報(bào)道序列DQ516703的同源性為99%。圖2為海南?？陔s色蛤仔序列對(duì)比圖。

表1 貝類采樣點(diǎn)位置和樣品Tab.1 The locations of shellfish sampling points and the samples

廣西北海、海南三亞、廣東湛江和廣東陽(yáng)江的近江牡蠣rDNA－ITS序列一致，命名為序列rDNA－ITS－2，與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中 P.beihaiensis已報(bào)道序列EF204067的同源性為100%。

比對(duì)海南海口雜色蛤和廣西北海近江牡蠣的rDNA－ITS－1與rDNA－ITS－2（圖3），同源性為85%。

圖2 海南?？诜坡少e蛤仔寄生帕金蟲與DQ516703序列對(duì)比圖Fig.2 Comparision of ITS sequence of perkinsus in R.philippinarumof Haikou Hainan and DQ516703

圖3 海南海口菲律賓蛤仔與廣西北海近江牡蠣寄生帕金蟲的ITS序列對(duì)比圖Fig.3 Comparision of ITS sequence of perkinsus in Ostrea rivularis Gouldof Beihai Guangxi and R.philippinarumof Haikou Hainan

將所得兩種rDNA－ITS序列與參考序列進(jìn)行基因比對(duì)，做成系統(tǒng)發(fā)生樹，見圖4。

圖4 帕金蟲的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree of Perkinsus

國(guó)際公布的7種帕金蟲中，P.olseni、P.honshuensis、P.mediterraneus、P.marinus的親緣關(guān)系較為接近，P.chesapeaki和P.beihaiensis次之，而P.qugwadi與其他6種帕金蟲的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)［11］。本試驗(yàn)檢測(cè)出的rDNA－ITS－1與rDNA－ITS－2分別與P.olseni和P.beihaiensis親緣關(guān)系最近。

rDNA－ITS－1 與 rDNA－ITS－2 的 差 異 為15%，可認(rèn)為rDNA－ITS－1與rDNA－ITS－2來(lái)自于兩種不同的帕金蟲；rDNA－ITS－1之間及與P.olseni參考序列的差異為1%，可能為P.olseni的不同的地理亞種。

3 結(jié) 論

我國(guó)遼寧、河北、山東、浙江、福建、廣東、廣西、海南等8省沿海存在著P.olseni和P.beihaiensis兩種帕金蟲。P.olseni從北至南廣泛分布，寄生于多地區(qū)的菲律賓蛤仔以及個(gè)別地區(qū)的毛蚶、紫貽貝、皺紋盤鮑等經(jīng)濟(jì)貝類體內(nèi)。P.beihaiensis僅在廣東、廣西、海南等南方海域的近江牡蠣中檢出。

我國(guó)沿海有13個(gè)省、市、自治區(qū)，本試驗(yàn)覆蓋了其中9個(gè)省，其中除江蘇省以外的8個(gè)省均呈帕金蟲rDNA－ITS PCR的陽(yáng)性擴(kuò)增。隨著貝類國(guó)際貿(mào)易的不斷增加和頻繁引種，帕金蟲經(jīng)由多種途徑傳播到我國(guó)沿海各地，適應(yīng)我國(guó)沿海環(huán)境后產(chǎn)生新的地理亞種，同時(shí)我國(guó)的帕金蟲也會(huì)經(jīng)由多種途徑傳播到其他國(guó)家。帕金蟲的危害極大，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)帕金蟲病害的監(jiān)測(cè)和防范，做好預(yù)防病害大規(guī)模發(fā)生的準(zhǔn)備工作。

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