王鵬　劉永蘭　雷小英　郭瑞娟　向安　郭晏海

[摘 要] 目的：以血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA為模板，克隆構(gòu)建HBV X蛋白質(zhì)的真核表達載體pcDNA-HBx。方法：設(shè)計擴增HBV X基因的In-Fusion PCR引物，采用高保真DNA聚合酶分兩段擴增HBV X基因序列；采用In-Fusion克隆技術(shù)，將兩段X基因擴增片段一步克隆入經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切的pcDNA3.0真核表達載體，以構(gòu)建重組真核表達載體pcDNA-HBX；采用Hind III和Xba I雙酶切和DNA序列測序篩選鑒定重組載體；pcDNA-HBx 轉(zhuǎn)染HepG2細胞，Western blot檢測pcDNA-HBx轉(zhuǎn)染細胞的HBx蛋白質(zhì)表達。結(jié)果：In-Fusion PCR引物分兩段擴增獲得全長HBx基因序列；In-Fusion獲得克隆的pcDNA-HBx經(jīng)雙酶切篩選得到陽性重組質(zhì)粒，測序分析證實插入序列正確；轉(zhuǎn)染pcDNA-HBX的HepG2細胞，Western blot證實表達HBx蛋白質(zhì)。結(jié)論：以血清HBV DNA為模板克隆HBV X基因，構(gòu)建了表達HBV HBx蛋白質(zhì)的真核表達載體，為HBx蛋白質(zhì)的生物學功能研究提供支持。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；HBV X基因；基因克??；表達載體；真核表達

中圖分類號：R511 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）02-001-05

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）感染是肝癌發(fā)生的主要危險因素之一。HBV 編碼的分子中與肝癌發(fā)生關(guān)系最密切的是X蛋白質(zhì)，HBV X基因編碼的X蛋白質(zhì)（the hepatitis B virus X，HBx）具有多種生物學功能，可與宿主細胞多種蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控宿主細胞基因表達，影響宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖與分化等，其對肝細胞周期與凋亡的影響是HBV致肝癌發(fā)生的重要機制之一[1-3]。因此，克隆HBV X基因進行HBx蛋白生物功能研究具有重要意義。

由于血清HBV DNA X基因的特殊結(jié)構(gòu)，使得克隆X基因較為困難。血清HBV病毒顆粒的基因組長約3.2kb，為帶有缺口的雙鏈不完全環(huán)形結(jié)構(gòu)DNA，稱為松弛環(huán)狀DNA（rcDNA），而X基因位于HBV基因組的1374bp～1838bp，正位于缺口處，而且該區(qū)域為高CG區(qū)。實驗發(fā)現(xiàn)：當以血清HBV rcDNA為模板時，用普通PCR一次擴增全長X基因，或用PCR分段擴增后再用PCR擴增拼接的X基因，所獲得全長X基因擴增片段經(jīng)常會出現(xiàn)序列缺失現(xiàn)象[4]。

為克服上述問題，我們采用In-Fusion克隆技術(shù)，將分段擴增的X基因片段一次連接克隆入真核表達載體中。In-Fusion克隆技術(shù)是利用In-Fusion Enzyme可準確將末端帶有15個相互重疊堿基序列的DNA片段融合連接的特性，將一個或多個外源基因片段一次克隆入目的質(zhì)粒中[5-6]。目的克隆基因片段末端的15 bp重疊堿基序列，是通過特定設(shè)計的In-Fusion引物加到擴增片段的末端。In-Fusion HD Cloning Kits 試劑盒可快速準確地將一個或多個外源DNA片段克隆到載體任何位置[7-8]。采用In-Fusion技術(shù)，以血清HBV DNA為模板，分段擴增并拼接X基因，將X基因準確地克隆入真核表達載體pcDNA3.0，獲得了可表達HBx蛋白質(zhì)重組真核表達載體。為HBx蛋白質(zhì)的生物學功能研究提供實驗條件。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器

表達載體pcDNA?3.0購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司；高保真PCR擴增反應液2×Pfu PCR MasterMix、TIANamp病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠DNA 回收試劑盒、感受態(tài)Top10購于天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶HindIII和Xba I、In-Fusion HD EcoDryTM Cloning Kit 購自寶生物工程（大連）有限公司；HepG2細胞株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；鼠抗HBxAg單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體購于圣克魯斯（Santa Cruz）生物技術(shù)公司；NanoDrop2000核酸濃度分析儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）。根據(jù)HBV rcDNA X的結(jié)構(gòu)特點，擬分HBX1和HBX2兩個片段擴增X基因，然后進行In-Fusion融合連接克隆，所用擴增引物（表1）用http：//bioinfo.clontech.com/infusion/在線軟件設(shè)計；化學發(fā)光底物（BeyoECL Plus Reagent A， B，D3308）。

表1 用于In-Fusion分段拼接克隆的

PCR引物序列

引物 引物序列 HBV基因組位置

P1 GTTTAAACTTAAGCTT CTTACCATGGCTGCTCGG 1368-1385nt

P2 GTGGTCTCCATGCGACGTGCAG 1618-1597nt

P3 TCGCATGGAGACCACCGTGAAC 1604-1625nt

P4 AAACGGGCCCTCTAGA AGGACATGAACATGAGATGATTAGG 1858-1834nt

注：P1下劃線部分與pcDNA3.0 HindIII位點5端15個堿基重疊，黑體斜體序列為HindIII識別序列，其余部分為X基因起始區(qū)域序列；P2、P3下劃線序列為反向互補的15個堿基；P4下劃線部分與pcDNA3.0 XbaI位點3端15個堿基重疊，黑體斜體序列為XbaI識別序列，其余部分為X基因終止區(qū)域互補序列。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 血清HBV DNA的PCR擴增 采用病毒DNA提取試劑盒分別提取4例HBV感染者血清HBV DNA（HBV病毒血清載量均大于106copies/mL），按圖1方案進行PCR擴增。PCR反應液配制：2×Pfu PCR MasterMix 12.5?L，引物P1和P2，或引物P3和P4各1?L（15pmol），HBV DNA樣品 3?L，去離子水補至30?L。反應程序：98℃預變性3min；98℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)30次；最后72℃延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下切下270bp處的目的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。用NanoDrop2000核酸濃度分析儀測定回收的核酸含量。

圖1 PCR分段擴增HBV X基因示意圖

注：P1和P2引物擴增HBX1片段，P3和P4引物擴增HBX2片段；兩擴增片段間有15個堿基的重疊序列，P1和P4引物的3端15個堿基分別與pcDNA3.0載體HindIII和XbaI雙酶切末端15個堿基序列重疊，上述重疊序列用于In-Fusion Enzyme融合連接克隆。虛線為HBV rcDNA殘缺的正鏈部分。

1.2.2 In-Fusion連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒鑒定 每個血清樣品獲得的PCR片段各10ng與HindIII和XbaI線性化pcDNA3.0載體50ng溶于去離子水，溶液總體積為10?L。將該10?L溶液加到一個 In-Fusion HD EcoDry 反應管中，用移液器將管內(nèi)In-Fusion HD EcoDry干粉徹底溶解。蓋好蓋后，反應管于37℃孵育15min，然后50℃加熱15min滅活I(lǐng)n-Fusion Enzyme，完成融合連接反應（原理見圖2），連接反應管置于冰上待轉(zhuǎn)化。取In-Fusion連接反應液3?L與50?L感受態(tài)Top10混合，按照In-Fusion操作說明進行重組載體感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，并接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中。37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌體增殖對數(shù)增長期時，保存菌種，其余收菌提取重組質(zhì)粒，進行HindIII和XbaI雙酶切鑒定和DNA測序。

圖2 HBx基因擴增片段與酶切pcDNA3.0載體In-Fusion克隆連接示意圖

1.2.3 轉(zhuǎn)染細胞 于60mm細胞培養(yǎng)皿中，接種5×105個細胞，培養(yǎng)基為6mL 含10%小牛血清的DMEM，5%CO2培養(yǎng)24h。當細胞融合度達到70%～90%時進行轉(zhuǎn)染操作，主要步驟為：6ug 質(zhì)粒DNA溶于600?L無血清DMEM，然后加入12?L TurboFect Transfecion Reagent轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置20min，將DNA和轉(zhuǎn)染劑混合物全部加到60mm細胞培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，輕輕搖勻轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。37℃ 5% CO2培養(yǎng)48h，提取細胞總蛋白質(zhì)。

1.2.4 Western blot分析 收集細胞蛋白質(zhì)，Bradford測定蛋白質(zhì)含量。取適量蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠中的蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜完畢后，膜用Western封閉液（P0023B） 4℃封閉過夜。加入稀釋（1：500）的鼠抗HBx單克隆抗體（sc-57760，Santa Cruz公司），4℃搖動孵育6h。 以稀釋的（1：1000）辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗小鼠IgG作為二抗。加入化學發(fā)光底物，用化學發(fā)光成像儀檢測HBx蛋白質(zhì)條帶。Actin抗體（AA128）作為內(nèi)參。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴增

采用In-Fusion PCR引物P1和P2、P3和P4，分別PCR擴增血清HBV DNA樣品，每個樣品獲得266bp和270bp擴增產(chǎn)物（見圖3）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收凝膠中特異PCR產(chǎn)物條帶，最后獲得30～50ng/?L濃度不等的擴增產(chǎn)物水溶液待用。

圖3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜

注：1和2、3和4、5和6、7和8分別為不同樣品X基因的X1和X2片段，X1片段大小為266bp，X2片段大小為270bp；M為分子量marker DL2000。

2.2 In-Fusion連接克隆

4個血清HBV DNA 均獲得克隆菌落，重組質(zhì)粒HindIII和XbaI雙酶切鑒定，均可切出長度為491bp插入的X基因的目的片段（見圖4）。對重組質(zhì)粒進行DNA測序，測序結(jié)果采用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast與HBV genotype C（LOCUS：AB033556）序列進行比對（見圖5），結(jié)果4株克隆序列與C基因型HBV X基因序列的同源性均大于97%（480/491=97.76%，481/491=97.96，482/491=98.17%，482/491=98.17%），4株克隆HBV X 基因序列之間均大于98%。證明采用In-Fusion技術(shù)方法將血清HBV DNA X基因克隆入pcDNA3.0。

圖4 重組質(zhì)粒pcDNA-HBX雙酶切電泳圖譜

注：1，3分別為兩個未經(jīng)酶切的pcDNA-HBX質(zhì)粒；2，4分別為經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切的圖譜，上方條帶為線性pcDNA質(zhì)粒（5.6kb），下方條帶為目的X基因片段，大小為491bp； M1為D2000分子量標準；M2為1kb DNA Ladder分子量標準。

2.3 Western blot 檢測

用pcDNA-HBX轉(zhuǎn)染HepG2細胞，提取細胞蛋白質(zhì)進行Western blot，采用HBx蛋白質(zhì)特異單克隆抗體進行檢查。結(jié)果可見相對分子量約為17 kDa的HBx條帶出現(xiàn)，而未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染pcDNA空載體的HepG2細胞中未檢出HBx蛋白質(zhì)（見圖6）。說明所構(gòu)建的HBx真核表達載體pcDNA-HBx可在HepG2細胞中表達HBx蛋白質(zhì)。

圖6 Wester blot印跡實驗結(jié)果

注：1. 用轉(zhuǎn)染HBx表達載體pcDNA-HBX的HepG2細胞提取的蛋白質(zhì)樣品，顯示有17kDa的HBx蛋白質(zhì)表達；2. 用轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒的HepG2細胞提取的蛋白質(zhì)樣品；3. 用未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞提取的蛋白質(zhì)樣品。M：標準分子量蛋白質(zhì)分子。

3 結(jié)論

采用In-Fusion克隆技術(shù)分段擴增并克隆帶有缺口的HBX基因，可獲得保真度高的重組克隆。由于HBV DNA 為松弛環(huán)狀DNA，其X基因區(qū)存在兩個缺口，同時該區(qū)GC含量較高，尤其是HBX1區(qū)域，GC含量高達65%[3]，因此用傳統(tǒng)的跨越缺口一步PCR擴增，獲得全長X基因序列并不容易，經(jīng)常發(fā)生克隆序列存在缺失或插入現(xiàn)象，造成克隆序列失真，影響表達X蛋白質(zhì)的功能。In-Fusion克隆技術(shù)是基于In-Fusion DNA連接酶可以高效、準確識別并融合兩個具有15個堿基重疊序列的DNA片段，避免了僅依靠退火溫度，控制DNA片段間拼接而造成的非特異結(jié)合。采用分段擴增X基因，可以避免X基因序列缺口對擴增效率和保真度造成的影響，同時采用針對GC含量較高區(qū)域的高保真DNA聚合酶PCR反應體系，保證擴增獲得的兩個X基因片段具有高保真度。擴增獲得的兩個X基因片段末端間、以及與載體的酶切末端都帶有15個特異重疊序列，In-Fusion DNA連接酶可以按照序列，準確地將它們連接起來，獲得重組質(zhì)粒。

與常規(guī)PCR引物設(shè)計相比，雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計稍顯復雜，但通過專業(yè)引物設(shè)計軟件（http：//bioinfo.clontech.com/infusion/），只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴增片段的引物序列，即可完成引物設(shè)計；另外，In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響，因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進行目的片段的擴增[9-11]。

本研究所用的克隆HBV X基因方法，可準確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因，為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時，也為多基因克隆以及基因定點突變提供解決方案。

參 考 文 獻

[1] Hongxia Fan， Xiaoli Yan， Yu Zhang， et at. Increased Expression of Gp96 by HBx-Induced NF-κB Activation Feedback Enhances Hepatitis B Virus Production[J].PLoS One， 2013， 8（6）： 655-688.

[2] Julie Lucifora1， Silke Arzberger， David Durantel， et al. ΜLrike Protzer. Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection[J]. Journal of Hepatology， 2011， 55（5）：996-1003.

[3] Gilad Doitsh， Yosef Shaul. A long HBV transcript encoding pX is inef?ciently exported from the nucleus[J]. Virology， 2003， 309（2）：339–349.

[4] 李菡，趙國強. HB x基因真核表達載體的構(gòu)建及表達[J]. 肝臟，2012，17（5）：332-334.

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[6] Mohamed Karamoko， Sara Cline， Kevin Redding， et al. Lumen Thiol Oxidoreductase1， a Disulfide Bond-Forming Catalyst， Is Required for the Assembly of Photosystem II in Arabidopsis[J]. PLANT CELL， 2011， 23（12）： 4462- 4475.

[7] Tian Luo， Jeeba A. Kuriakose， et al.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription， Signaling， and Cytoskeleton Organization[J]. Infect. Immun， 2011， 79（11）： 4382 - 4391.

[8] Takeshi Shimi， Veronika Butin-Israeli， Stephen A. Adam， et al. The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence[J]. Genes & Dev， 2011，（ 25）： 2579 - 2593.

[9] ?ric Bergeron， César G. Albari?o， et al. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Function[J]. J. Virol.， Jan 2009， 84（1）： 216 - 226.

[10] GABILLY S T，DREYFUSS B W，KARAMOKO M，et al.Ccs5， a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press，2010，285（39）：29738-29749.

[11] Peihua Jiang， Jesusa Josue， Xia Li， et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（13）：4956-4961.

與常規(guī)PCR引物設(shè)計相比，雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計稍顯復雜，但通過專業(yè)引物設(shè)計軟件（http：//bioinfo.clontech.com/infusion/），只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴增片段的引物序列，即可完成引物設(shè)計；另外，In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響，因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進行目的片段的擴增[9-11]。

本研究所用的克隆HBV X基因方法，可準確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因，為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時，也為多基因克隆以及基因定點突變提供解決方案。

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與常規(guī)PCR引物設(shè)計相比，雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計稍顯復雜，但通過專業(yè)引物設(shè)計軟件（http：//bioinfo.clontech.com/infusion/），只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴增片段的引物序列，即可完成引物設(shè)計；另外，In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響，因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進行目的片段的擴增[9-11]。

本研究所用的克隆HBV X基因方法，可準確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因，為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時，也為多基因克隆以及基因定點突變提供解決方案。

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[8] Takeshi Shimi， Veronika Butin-Israeli， Stephen A. Adam， et al. The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence[J]. Genes & Dev， 2011，（ 25）： 2579 - 2593.

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[10] GABILLY S T，DREYFUSS B W，KARAMOKO M，et al.Ccs5， a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press，2010，285（39）：29738-29749.

[11] Peihua Jiang， Jesusa Josue， Xia Li， et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（13）：4956-4961.