利煥廉　周金文　蔡曉華

[摘 要] 目的：探討尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血糖及視網(wǎng)膜功能的影響。方法：48只健康大鼠隨機(jī)選取10只為正常對(duì)照組，38只建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型后，20只采用尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞，18只注射等量安慰劑。觀察間充質(zhì)干細(xì)胞在肝、脾、腎、胰腺和眼球的分布以及在視網(wǎng)膜的分化特點(diǎn)，監(jiān)測(cè)注射后1、2、3、4wk血糖變化，觀察血-視網(wǎng)膜屏障破壞修復(fù)情況。結(jié)果：BMSCS在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布，視網(wǎng)膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在。實(shí)驗(yàn)組大鼠的血糖水平均隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，注射后第1 wk血糖差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EB滲漏量較基線明顯減少。結(jié)論： BMSCs可降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血糖，使血-視網(wǎng)膜屏障得到一定程度修復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病視網(wǎng)膜病變；間充質(zhì)干細(xì)胞； 血糖；血-視網(wǎng)膜屏障

中圖分類號(hào)：R774 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2055-5200（2014）02-031-04

前 言

糖尿病的眼部并發(fā)癥包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）、白內(nèi)障、暫時(shí)性屈光不正以及出血性青光眼，其中DR作為全世界導(dǎo)致視力缺損和失明的第二大因素，在研究糖尿病眼部并發(fā)癥中有重要意義[1]。DR主要臨床表現(xiàn)可分為視網(wǎng)膜缺血缺氧與血管通透性增加兩類。視網(wǎng)膜缺血缺氧[2]又可分為棉絮斑、微血管瘤、新生血管、出血、靜脈管徑變化、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、增殖膜形成。血管通透性增加主要包括滲出與出血。近幾年我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平增長(zhǎng)，糖尿病患者明顯增多。DR會(huì)直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞等發(fā)生病理性改變。視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的改變會(huì)引起微血管病變，微血管病變又會(huì)加重視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的程度，兩者相互作用從而形成惡性循環(huán)。靜脈和玻璃體腔注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells， BMSCs）可分化為視網(wǎng)膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞以穩(wěn)定新生血管，進(jìn)而避免發(fā)生出血和滲出癥狀[3]。本文通過(guò)建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)DR大鼠血糖及視網(wǎng)膜功能的影響，觀察視網(wǎng)膜中BMSCs表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1 模型建立及分組 本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)部門審批合格后開展，所有的動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)程均遵循動(dòng)物試驗(yàn)規(guī)范。實(shí)驗(yàn)所需50只健康的雄性5-7wkWistar大鼠由深圳市人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。50只大鼠，體重180g至220g，抽取10只作為正常對(duì)照組（A組），其余40只對(duì)大鼠進(jìn)行12 h空腹飼養(yǎng)，之后按60 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射2%鏈脈佐霉素（STZ），1 wk后動(dòng)物血糖水平>16.65mmol/L，尿糖超過(guò)3+，糖尿病大鼠模型建立；2只死亡，38只建模成功，模型建立后對(duì)大鼠進(jìn)行觀察，10wk后，抽取DM大鼠及正常大鼠各2只進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片觀察，比較觀察正常大鼠和DM大鼠微血管形態(tài)變化，確定DM大鼠已患有早期DR。

以隨機(jī)數(shù)字表法將DR大鼠分為2組，B組20只為尾靜脈注射BMSCs組，C組18只為DR對(duì)照組注射安慰劑。將大鼠固定在鼠盒內(nèi)，酒精棉球消毒尾部，1mL注射器抽取0.5mL濃度為1×107BMSCs，勻速推入。對(duì)照組予以等量安慰劑尾靜脈注射。

1.1.2 主要試劑 鏈脈佐霉素（STZ）、伊文斯藍(lán)（EB）、戊巴比妥鈉（美國(guó)sigma公司）；檸檬酸鈉、甲酞胺、40%福爾馬林與檸檬酸（北京化學(xué)試劑公司）； 0.9%生理鹽水（北京雙鶴藥業(yè)公司）；小鼠抗人核單克隆抗體、小鼠抗Rhodopsin單克隆抗體（美國(guó)Chemieon公司）；小鼠抗vWF單克隆抗體、小鼠抗CDgO單克隆抗體（美國(guó)AbDSeretee公司）；羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠Ig抗體、5%羊血清原液（中杉金橋生物技術(shù)公司）；PBS粉劑（pH7.2-7.4）（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；TritonX-100（美國(guó)eBioscienee公司）。

1.1.3 儀器設(shè)備 血糖儀、血糖試紙（德國(guó)Roche公司）；Syllefgy4酶標(biāo)儀（美國(guó)Bioteek公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)NBS公司）；尿糖試紙（廣州珠江生化試劑有限公司）；D70顯微數(shù)字成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）； SDEI烘箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；動(dòng)靜脈導(dǎo)管、lmL、5mL注射器等均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng)BMSCs [5] Wistar大鼠（出生5天）進(jìn)行頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下取出股骨、脛骨及肱骨。以無(wú)菌注射器穿刺抽取骨髓5mL，抽取等量含10%FBS之培養(yǎng)基，將骨髓沖出至一個(gè)10mL無(wú)菌離心管中，混勻后1500轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，用L-DMEM重懸細(xì)胞，然后過(guò)濾成單細(xì)胞，置于37°、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行靜置培養(yǎng)。

1.2.2 組織學(xué)處理[6] 大鼠用過(guò)量麻醉的方法處死，將其胸腔剖開以暴露心臟，心內(nèi)灌注25mlL4%多聚甲醛后立即摘除大鼠雙眼眼球，同時(shí)取大鼠部分肝、脾、腎、胰腺、肺組織，并將各組織24h浸泡于10%中性甲醛中，后經(jīng)常規(guī)脫水，透明浸臘包埋進(jìn)行染色及免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 EB滲漏測(cè)定血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）功能 10%水合氯醛液0.4mL/kg，腹腔注射麻醉。暴露右頸靜脈，EB45mL/kg由靜脈緩慢注入，觀察眼球、尾巴及四肢變?yōu)樗{(lán)色即認(rèn)為注射成功。注射后循環(huán)120min，之后打開動(dòng)物胸腔，將預(yù)熱至37℃的檸檬酸緩沖液稀釋的1%多聚甲醛由左心室灌注，灌注壓為120mmHg（66mL/min），灌注后，立即摘取眼球，斷頸處死動(dòng)物。分離視網(wǎng)膜，4°C過(guò)夜晾干后稱干重。將視網(wǎng)膜與150mL甲酰胺在70℃下孵育8 h。然后將提取液移入超濾離心管，離心機(jī)4℃6000 r/min高速離心90min。取上清液120mL用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度值，測(cè)定620nm和740nm2種波長(zhǎng)樣品的吸光度值之差（凈吸光度值），建立EB染料濃度在甲酸胺中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每一樣品測(cè)量3次.取其平均值。計(jì)算各標(biāo)本中EB濃度，定量計(jì)算BRB損傷滲漏情況。

1.2.4 觀察指標(biāo) 記錄基線及尾靜脈注射后第1、2、3、4wk血糖值。觀察BMSCs在大鼠全身分布情況與其在大鼠視網(wǎng)膜局部的分布。各組伊凡斯藍(lán)滲漏量。

1.3 數(shù)據(jù)與圖像處理

利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用x±s表示，計(jì)量資料采用多組間秩和檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖像利用Olympus Image-pro Discovery圖像處理軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs在全身臟器的分布

尾靜脈注射BMSCs組，注射后第1wk即可發(fā)現(xiàn)BMSCS在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布。角膜及胰腺的部分胰管、胰泡中同樣存在BMSCs。圖1為BMSCs在腎臟和胰腺中分布圖。

2.2 BMSCs在視網(wǎng)膜局部的分布

如圖2所示，尾靜脈注射BMSCs組視網(wǎng)膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在著，BMSCs卻很少出現(xiàn)在其視網(wǎng)膜內(nèi)層及節(jié)細(xì)胞層。

圖2 BMSCs在視網(wǎng)膜的分布

A： 視網(wǎng)膜外核層中的BMSCs分布，B：視網(wǎng)膜內(nèi)層的BMSCs分布，C：節(jié)細(xì)胞層的BMSCs分布

2.3 BMSCs對(duì)血糖的影響

A組（健康對(duì)照組）大鼠血糖與B組（尾靜脈注射BMSCs組）C組（尾靜脈注射安慰劑組）基線血糖差異顯著。BC兩組大鼠血糖不存在顯著性差異。注射干預(yù)血糖水平隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)，初始下降較快，1wk后B組血糖與基線值和C組存在顯著性差異。4wk后B組血糖未下降到健康對(duì)照組水平。具體數(shù)據(jù)如表1所示。

BMSCs干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響（x±s，mol/L）

時(shí)間 正常對(duì)照組

（n=10） 注射BMSCs組

（n=20） 注射安慰劑組

（n=18）

基線 7.0±1.7 23.7±3.9 22.1±2.9

第1wk 6.3±1.8 18.4±2.1* 24.1±3.7

第2wk 7.3±0.9 15.7±2.2# 23.5±2.6

第3wk 6.5±1.4 13.5±3.1 23.0±2.8

第4wk 6.6±1.2 12.6±3.3 22.5±3.1

注：與注射安慰劑組比較 *p<0.05，#p<0.01

2.4 BMSCs對(duì)BRB功能影響

DR模型組基線水平EB滲漏量與正常對(duì)照組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組注射前基線水平EB滲漏量為19.2±3.1（mL/g.h），注射BMSCs后滲漏量下降為8.6±1.7（mL/g.h），P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組注射前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種可引起局部視網(wǎng)膜缺氧、血管通透性增加的微血管病變，嚴(yán)重影響患者的生活[7]。糖尿病在中國(guó)發(fā)病率已經(jīng)高達(dá)9.7%，患病人口接近1億。隨著我國(guó)糖尿病人的增多，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者致盲也呈上升趨勢(shì)，糖代謝紊亂是DM患者發(fā)生DR的根本原因，DR的發(fā)展是一個(gè)緩慢的過(guò)程。相關(guān)研究資料表明，50%以上的糖尿病患者在患病5-10年后會(huì)發(fā)生視網(wǎng)膜病變，15年后則高達(dá)75%-80%。

DR早期病理基礎(chǔ)是BRB破壞。BRB由外屏障和內(nèi)屏障兩部分組成。外屏障由視網(wǎng)膜色素、上皮細(xì)胞間緊密連接和包含大量細(xì)胞橋粒的閉鎖小帶構(gòu)成。內(nèi)屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接及周細(xì)胞構(gòu)成，血管旁的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（星形細(xì)胞和Muller細(xì)胞）對(duì)其起支撐作用，內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用可以使內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接加強(qiáng)。BRB損傷表現(xiàn)為其通透性增加和緊密連接蛋白變化。Kim等[8]發(fā)現(xiàn)DM大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin、zo-1明顯低于對(duì)照組。

BMSCs是成體干細(xì)胞中的研究較活躍的一種，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)己證實(shí)其具有向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等其它組織分化的能力。在眼底研究方面，2002年Otani等[9]和Tomita等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈和玻璃體腔注射的干細(xì)胞可分化為視網(wǎng)膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞，并推測(cè)干細(xì)胞可能能夠穩(wěn)定新生血管，從而阻止出血和滲出的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尾靜脈注射BMSCs后，其在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布，視網(wǎng)膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在。說(shuō)明全身性靜脈干預(yù)的干細(xì)胞能夠通過(guò)BRB，在目標(biāo)組織中達(dá)到有效的數(shù)量以起到治療作用。BRB在DR早期就會(huì)出現(xiàn)損傷，尾靜脈注射方式可使BMSCs到達(dá)視網(wǎng)膜，部分修復(fù)了DR引起的BRB功能損傷。BMSCs對(duì)視網(wǎng)膜血管的修復(fù)作用機(jī)制可能與分化形成的小膠質(zhì)細(xì)胞的功能有關(guān)[11]。MSCs能夠在存在視網(wǎng)膜變性病變的小鼠和大鼠模型中表現(xiàn)出視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的形態(tài)和功能，延長(zhǎng)自體光感受器細(xì)胞的存活時(shí)間[12-13]。

BMSCs誘導(dǎo)下干預(yù)組血糖下降約54%，可BMSCs有顯著降低血糖的功效。根據(jù)4wk血糖測(cè)定的結(jié)果可知，對(duì)血糖的干預(yù)主要是在2wk內(nèi)完成的。其機(jī)理可能是BMSCs可以誘導(dǎo)胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)抑素表達(dá)。

大鼠尾靜脈注射BMSCs可以在視網(wǎng)膜目標(biāo)組織達(dá)到一定數(shù)量，部分修復(fù)DR引起的視網(wǎng)膜功能損傷，并在胰腺肝腎等多器官分布，降低糖尿病患者血糖。

參 考 文 獻(xiàn)

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