劉志剛　熊敏　曾云　余化龍　何寧

[摘 要] 目的：探討體外培養(yǎng)條件下DA-2006促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的效果與機(jī)制。方法：取兔股骨， 骨髓腔進(jìn)行沖洗， 采用全骨髓法分離純化培養(yǎng)BMSCs，培養(yǎng)至第3代后，分別利用誘導(dǎo)培養(yǎng)液（組A），添加DA-2006的培養(yǎng)液（組B）以及普通培養(yǎng)液（對(duì)照組）培養(yǎng)BMSCs，采用噻唑藍(lán)（MTT） 檢測(cè)3組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖能力， 利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)骨堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OC）、骨橋蛋白（OPN）等成骨性標(biāo)志基因的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)過誘導(dǎo)后，組B細(xì)胞具有良好的形態(tài)，擴(kuò)增能力迅速。在生長(zhǎng)率方面，誘導(dǎo)組B較強(qiáng)于誘導(dǎo)組A，對(duì)照組團(tuán)塊化程度最低。對(duì)照組的表達(dá)量最低，同時(shí)組B的ALP、OC、OPN表達(dá)量明顯高于組A（P<0.05）。結(jié)論：在含DA-2006的細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)環(huán)境下，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化強(qiáng)于經(jīng)典的地塞米松誘導(dǎo)效果，其機(jī)制的發(fā)揮可能與上調(diào)ALP、OC與OPN的表達(dá)水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；成骨細(xì)胞；誘導(dǎo)分化

中圖分類號(hào)：R681 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2055-5200（2014）02-035-04

前 言

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞的一種，具自我更新和多分化潛能，具備成為種子細(xì)胞[1-2]的可能，在組織工程發(fā)展的熱潮中引起科學(xué)工作者關(guān)注，但圍繞骨髓干細(xì)胞的相關(guān)研究尚處于起步階段[3-4]。膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）可以通過跨膜的酪氨酸蛋白激酶受體RET激活細(xì)胞內(nèi)多巴胺（DA）神經(jīng)信號(hào)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和分化過程。aDA-2006是本實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)中篩選、發(fā)現(xiàn)的一種易透過細(xì)胞膜、無(wú)細(xì)胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本實(shí)驗(yàn)具體分析DA-2006促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的機(jī)制，為骨組織工程的臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇南京青龍山的3周齡新西蘭大白兔（雄性）。實(shí)驗(yàn)試劑與相關(guān)儀器：Trizol（美國(guó)Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式會(huì)社），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo株式會(huì)社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（維森特生物技術(shù)有限公司）、細(xì)胞孵育箱（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司） 、超凈工作臺(tái)（浙江安泰醫(yī)藥有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 脫頸處死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔脛骨結(jié)節(jié)0.5-1cm處分別抽取骨髓1.5mL，同時(shí)加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，將液體移至50mL離心管中，1400rpm/min轉(zhuǎn)速離心5-10min，吸去上清及脂肪層，然后在離心管中添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液4 mL，進(jìn)行顛倒混勻20次，按1×106個(gè)細(xì)胞/cm2的密度，將細(xì)胞接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于飽和濕度孵箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)。經(jīng)48h細(xì)胞培養(yǎng)后，換液50%，去除未貼壁細(xì)胞、紅細(xì)胞等，以后每72h進(jìn)行一次換液。原代培養(yǎng)9-12d后細(xì)胞達(dá)80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化后傳代[2]。

將第2代細(xì)胞分3組進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)組A采用誘導(dǎo)培養(yǎng)液[4]（普通培養(yǎng)液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸鈉，50mg/L維生素C），誘導(dǎo)組B采用含1?LMDA-2006的普通培養(yǎng)液。對(duì)照組采用普通培養(yǎng)液。

1.2.2 檢測(cè)方法 （1） PCR檢測(cè)標(biāo)志基因的表達(dá)：取傳至第3代BMSCs細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反復(fù)輕微吹打細(xì)胞，致細(xì)胞脫落，1000rpm/min離心細(xì)胞收取，轉(zhuǎn)至1.7mL離心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混勻，5min室溫靜置，然后11000rmp離心，時(shí)間為15min。將上層的水相轉(zhuǎn)入到1.5mLEP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后放于-20℃冰箱中，過30min后，11000rmp離心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000rmp離心6min。棄上清，靜置5min。

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用Primer Premier 5.0的軟件設(shè)計(jì)、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技術(shù)有限公司），其特異性利用融解曲線進(jìn)行分析驗(yàn)證。

cDNA表達(dá)豐度采用Ct值進(jìn)行檢測(cè)，β-actin的Ct值作為內(nèi)參。

反轉(zhuǎn)錄結(jié)束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按說明書進(jìn)行熒光定量PCR。

3步法進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下表1。

表1 Q-PCR擴(kuò)增條件

溫度（°C） 時(shí)間（S） 循環(huán)次數(shù)

95 10 1

92 15 45

60 20 45

72 35 45

（2）MTT法測(cè)生長(zhǎng)率：各組細(xì)胞， 經(jīng)胰酶消化后， 進(jìn)行計(jì)數(shù)， 以2.5*103/L接種于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3組均處于37℃、5%CO2 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在檢測(cè)前，每孔加入4mg/mLMTT25L，繼續(xù)培養(yǎng)3h， 吸棄培養(yǎng)液， 每孔添加150?L DMSO，振蕩10min， 利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在490nm 波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)各孔吸光光度值，每日檢測(cè)3孔， 進(jìn)行均值計(jì)算。

觀察不同組別不同時(shí)期細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，在3組的第3代傳代細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行生長(zhǎng)率的判斷與計(jì)算。同時(shí)觀察不同組別的ALP、OC、OPN基因表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)采用x±s顯示，組間差異比較，用兩樣本的均數(shù)t 檢驗(yàn)，P<0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)情況

細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)如下：具有良好狀態(tài)，具有梭形形狀，且放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞間貼附緊密，70%細(xì)胞沿細(xì)胞體的長(zhǎng)軸排列有序（見圖1），細(xì)胞具有良好的純度。通過0.25%胰蛋白酶消化后，傳代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)明顯速度增加。但傳至20代左右，生長(zhǎng)速度會(huì)逐漸減慢，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生顆粒狀的堆積物。

圖1 傳代第3代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（×100）

2.2 生長(zhǎng)率情況

該實(shí)驗(yàn)分為誘導(dǎo)組A，即誘導(dǎo)培養(yǎng)液組，誘導(dǎo)組B，即含DA-2006的培養(yǎng)液組，對(duì)照組，即普通培養(yǎng)液組。通過MTT法，在3組的第3代傳代細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線（見圖2）

3組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一周的細(xì)胞培養(yǎng)后，3組BMSCs細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的團(tuán)塊化，但誘導(dǎo)組B較強(qiáng)于誘導(dǎo)組A，對(duì)照組團(tuán)塊化程度最低（B組相比于A組，F(xiàn)=0.152，P=0.453），說明組B的誘導(dǎo)能力高于其他兩組，但是無(wú)明顯差異。

圖2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

2.3 成骨分化標(biāo)志基因表達(dá)情況

標(biāo)志骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，這些基因在骨形成中擔(dān)當(dāng)著重要作用。通過熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)這3個(gè)標(biāo)志基因在添加有誘導(dǎo)培養(yǎng)液或者含DA-2006的培養(yǎng)液的條件下的表達(dá)變化（見圖3）。結(jié)果顯示對(duì)照組的表達(dá)量最低，同時(shí)組B的ALP、OC、OPN表達(dá)量明顯高于組A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。

圖3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化標(biāo)志基因表達(dá)情況

3 討論

當(dāng)前骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作為載體在細(xì)胞治療和基因治療方面的價(jià)值[6-7]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)較容易從骨髓中抽取分離，同時(shí)較容易進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染多種外源基因。因此，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相比HSCs在基因治療方面有更多優(yōu)勢(shì)[8-10]，例如HSCs的分離需求大量的骨髓，并且這些細(xì)胞是很難大批量體外培養(yǎng)的。

經(jīng)典的誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的方法包括流式細(xì)胞儀分離技術(shù)，密度梯度離心法，貼壁篩選法[11-12]。操作較簡(jiǎn)單的方法為貼壁篩選法，該法篩選的細(xì)胞容易成活。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，換液次數(shù)減少可以保護(hù)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的活力。

多巴胺受體可能作為腫瘤干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元并觀察其中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)情況，研究指出，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可向多巴胺能神經(jīng)元分化，且分化后的細(xì)胞可表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。而對(duì)于誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]進(jìn)行誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)探討人工合成的小分子化合物DA-2006的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示3組BMSCs細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的團(tuán)塊化，但誘導(dǎo)組B較強(qiáng)于誘導(dǎo)組A，對(duì)照組團(tuán)塊化程度最低，而且誘導(dǎo)組B的密集程度最高，說明含DA-2006的培養(yǎng)液條件下的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性比較強(qiáng)，該結(jié)果也驗(yàn)證了增值與分化的矛盾統(tǒng)一原理[14-15]。

人類的骨質(zhì)是由成骨細(xì)胞進(jìn)行骨質(zhì)的累積和破骨細(xì)胞進(jìn)行骨質(zhì)的降解相平衡的一個(gè)完美的平衡過程。近年來(lái)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ALP、OC、OPN參與了腫瘤形成、細(xì)胞增殖和分化、病毒防御等幾乎所有的生物學(xué)過程，它可能有非常廣泛多樣的生物功能。本文通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后的相關(guān)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)變化，可以反應(yīng)其成骨分化水平，骨堿性磷酸酶（LAP）作為成骨細(xì)胞表型的標(biāo)志物之一[16，17]，可反映成骨細(xì)胞的活性和功能狀況，主要應(yīng)用于小兒佝僂病早期診斷，骨源性堿性磷酸酶從骨質(zhì)中分泌，當(dāng)骨頭中鈣鹽沉淀出現(xiàn)不足時(shí)，分泌會(huì)增多，骨中鈣鹽充足則分泌減少。同時(shí)相關(guān)研究顯示，在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞時(shí)，OPN與OC的表達(dá)水平顯著上調(diào)。本文結(jié)果顯示，對(duì)照組的表達(dá)量最低，同時(shí)組B的ALP、OC、OPN表達(dá)量明顯高于組A?？赡軝C(jī)制在于作為干細(xì)胞一種開關(guān)的多巴胺能控制成骨中新細(xì)胞的形成。如果多巴胺信號(hào)被抑制，它們就不能產(chǎn)生新的成骨細(xì)胞。

總之，本研究探討了DA-2006對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的作用及分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)在含DA-2006的細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)環(huán)境下，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化情況較強(qiáng)于經(jīng)典的地塞米松誘導(dǎo)效果，其機(jī)制的發(fā)揮可能與上調(diào)ALP、OC與OPN的表達(dá)水平有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

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