葉迎賓 黃秀香 李軍 章健 田楠楠 王秀芹 趙斗貴

原發(fā)性肝癌(PHC)在我國已成為第二惡性腫瘤，有56%的癌癥患者為肝癌。普遍認為肝癌的發(fā)生是一個包括癌基因激活和抑癌基因失活的多因素、多步驟過程［1］。但關于肝癌的確切病因尚不清楚。在我國主要以病毒性肝炎(HBV、HCV)的慢性持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的主要背景，乙型肝炎相關者占70% ～80%，丙型與丁型肝炎相關者為15% ～20%［2］。約5%的肝癌可能與黃曲霉毒素、飲用水污染、遺傳因素等有關［2］。往往當發(fā)現(xiàn)肝癌時，大多錯過最佳的治療時間，如何能及早發(fā)現(xiàn)肝癌呢?當務之急就是要找到一種對肝癌細胞靈敏度和特異性高的標志物［如甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體糖蛋白73(GP-73)］。本文通過對肝癌患者的AFP-L3、GPC3、GP-73的檢測數(shù)據(jù)的分析，探討三者聯(lián)合檢測來診療肝癌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年5月至2012年12月，在我院肝病科住院且經(jīng)病理學或符合AFP診斷標準證實的肝癌患者154例(肝癌組)，其中男95例，女59例;年齡36～76歲，平均年齡53.9歲。肝硬化患者78例(肝硬化組)，其中男56例，女22例;年齡30～66歲，平均年齡48.3歲。肝硬化患者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》［3］中肝硬化診斷標準。肝癌診斷符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)［4］。正常體檢者56例為對照組，其中男39例，女17例;年齡20～36歲，平均年齡25.4歲。

1.2 儀器與試劑 儀器為Thermo公司的 MK3酶標儀(簡稱“酶標儀”);AFP-L3、GPC3、GP-73試劑盒均由上海雅吉生物科技有限公司提供。檢測AFP的儀器為西安核儀器廠提供的XH-6080十探頭全自動智能γ免疫計數(shù)器，其試劑盒有北京北方生物技術研究所提供，嚴格按照說明書操作。

1.3 檢測方法 取被檢者空腹靜脈血5 ml，分離血清，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。AFP-L3、GPC3、GP-73三者檢測均采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書操作。用酶標儀檢測其OD值，根據(jù)標準濃度曲線圖，分別計算出其濃度。AFP檢測采用放射免疫法，AFP＞20 μg/L，AFP-L3% ＞10%視為陽性;GPC3檢測值 ＞3.0 μg/L 視為陽性;GP-73 檢測值 ＞150 μg/L 視為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用采用t檢驗(LSD)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)來確定最佳臨界值，計算ROC曲線下的面積(AUG)，采用單樣本t檢驗比較AUG、敏感度和特異度，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3 組中血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP比較 PHC組血清指標檢測結果與肝硬化組和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。3組中相同項目兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 3 組血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

表1 3 組血清中 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 含量以及AFP-L3/AFP±s

注:與肝癌組比較，*P ＜0.01;與肝硬化組比較，#P ＜0.01

組別 AFP(μg/L) GP-73(μg/L)GPC3(μg/L) AFP-L3(μg/L)AFP-L3/AFP(%)肝癌組(n=154) 2 124±2 183 174±54 10.7±3.1 338.6±379.2 13.8±4.0肝硬化組(n=78) 84±49* 82±36* 2.7±0.7* 6.4±2.8* 8.8±3.9*對照組(n=56) 11±6*# 17±13*# 1.3±0.6*# 0.7±0.6*# 6.3±2.7*#F值63.1 266.9 411.1 56.3 126.8 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 GP-73、GPC3和 AFP-L3三者聯(lián)合檢測結果

GP-73、GPC3和AFP-L3三者中有一項為陽性即為聯(lián)合檢測陽性(并聯(lián)實驗)，敏感度97.9%(282/288)，特異度 79.5%(105/132)，準確度 87.5%(387/442)。三者的敏感度和準確度高于任何兩者聯(lián)合和單項的敏感度和準確度(P＜0.05)，特異度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 GP-73、GPC3和AFP-L3單項和聯(lián)合檢測對PHC的診斷價值比較 %(例)

2.3 血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3 的含量對 PHC的診斷價值 以AFP-L3＞10%為判斷標準，根據(jù)ROC曲線結果，以診斷PHC的靈敏度與特異度之和的最高值確定臨界值，血清 AFP、GP-73、GPC3、AFP-L3診斷PHC 的臨界值分別為 1 255.0、162.5、9.7 和 119.2。見圖1、表3。

圖1 AFP、GP-73、GPC-3和AFP-L3檢測診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

表3 GP-73、GPC-3和AFP-L3檢測對PHC的診斷價值 %(例)

2.4 不同AFP水平的肝癌組的GP-73、GPC3、AFP-L3的陽性變化 GP-73在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AFP-L3(%)在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。GPC3的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4 不同AFP水平在肝癌組中GP-73、GPC3、AFP-L3%的陽性率

3 討論

AFP是目前臨床上最主要、應用最廣泛的PHC早期篩查血清標志。但是有1/3的慢性肝病、肝纖維化和肝硬化出現(xiàn)AFP不同程度的升高，有1/3的PHC患者不升高［5］。導致AFP的敏感度和特異度不高，不能滿足臨床需要。由于不同研究的設計方案不同、樣本量差異、AFP臨界值設定不同等多方面原因造成敏感性有差異［6］。本文以AFP-L3% ＞10%為標準，AFP診斷PHC的臨界值為1 255.0 μg/L，遠大于參考區(qū)間(0～20 μg/L)，敏感度為48.1%，特異度為100%?？赡芘c標本的收集或者檢測方法有直接關系，有待進一步論證。

AFP-L3為肝癌細胞特異產(chǎn)生，表達AFP-L3的肝癌細胞有早期血管浸潤和轉移的傾向，ALF-L3%(AFP-L3/AFP)越高提示腫瘤的惡性程度越高［7］。丁賢等［8］報道，表明AFP-L3用于肝癌的診斷不受AFP≥400 μg/L作為肝癌診斷標準的限制，當AFP-F3%＞10%而AFP輕度升高提示發(fā)生肝癌的可能性較大。由于AFP-L3%不受AFP水平的影響，因此檢測AFPL3%是AFP低濃度持續(xù)陽性患者及小肝癌AFP尚未明顯升高時早期預報肝癌發(fā)生的重要指標［9］。何建偉等［10］報道AFP-L3%非常適用于PHC和肝硬化鑒別診斷，同時也適用低濃度AFP持續(xù)陽性的良、惡性肝病的鑒別診斷。從表4中得知，肝癌組中隨著AFP水平越高AFP-L3%的陽性(59.1%)率越高，與其他3個水平相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.842，P=0.000)。在PHC和肝硬化的鑒別診斷，ALP-L3運用具有明顯的優(yōu)勢(F=126.8，P=0.000)。

GPC3是一類細胞表面的糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育、分化和遷移等行為，在機體的生長、發(fā)育中起著重要的作用［11］。2010年7月由 Bruix等［12］共同指出，小病灶的肝活組織病理學檢查不能確認為HCC的組織，應用所有可用標志物之一的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3進行染色，以提高診斷準確性。宋孟锜等［13］指出，GPC3在肝癌組織表達高于癌旁和正常肝組織，GPC3與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、HBsAg及AFP水平無明顯相關，而與病理分級和臨床分期有關。到目前為止，本次實驗結果中，PHC組的GPC3明顯高于肝硬化組和正常對照組，與后者相比差異有統(tǒng)計學意義(F=411.1，P＜0.01)。雖然 GPC3隨 AFP的水平升高而陽性率增多，但差異無統(tǒng)計學意義(F=2.222，P＞0.05)。文獻多次報道提示臨床要慎重對待高于正常肝組織的GPC3的檢測值，要科學合理地進行檢查，防止漏檢，進而提高肝癌的診治率［14－16］。

GP-73是存在于高爾基體的一種跨膜糖蛋白，在正常的人體肝組織中主要由膽管上皮細胞表達，而肝細胞表達很少甚至不表達。在急、慢性肝炎或肝硬化中，GP-73表達明顯升高［17］。本實驗中，肝癌組明顯高于肝硬化組和正常對照組(F=266.9，P＜0.01)，與曾經(jīng)的文獻報道［18－20］一致。在AFP不同水平中肝癌組的GP73陽性率高于肝硬化組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=2.977，P＜0.033)，說明血清中GP73的濃度與AFP的水平有關，這與Sun等［21］報道不同，后者指出血清GP73與腫瘤大小、分化程度無相關，本實驗結果有待進一步證實。

多項腫瘤標志物聯(lián)合檢測可降低有單一標志物所致的漏診和誤診，能有效提高診斷的準確率，彌補單項的不足［22，23］。檢測本實驗結果顯示，三者聯(lián)合檢測GP-73、GPC3和 AFP-L3%的敏感度(97.9%)和準確度(87.5%)較單獨檢測或任兩項聯(lián)合檢測高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但特異度較低。聯(lián)合檢測對肝癌早期診斷及AFP陰性肝癌的篩選有很多的臨床意義，也有助于良惡性肝病的鑒別［24］。房萌等［5］報道GP-73在肝硬化中顯著上升，作為PHC診斷標志應需臨床大量標本進一步驗證。馬桂英等［25］研究顯示有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平也可增高，故僅檢測AFP易造成漏診和誤診。從表4中顯示，GP-73和AFP-L3在肝癌組不同AFP水平的變化差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當 AFP≤400 μg/L不能確診肝癌時，可以檢測 GP-73、GPC3和AFP-L3對AFP的不足做出彌補，達到早發(fā)現(xiàn)、早治療的效果。GP-73、GPC3和AFP-L3在肝癌中的含量明顯高于肝硬化組，這說明肝硬化向肝癌轉化的過程中，定期觀察標志物的濃度變化對肝癌早期的判斷提供重要的依據(jù)。

總之，肝癌是一種復雜性的疾病，單一的高特異性和敏感性的生物標志物不可能檢測所有的肝癌患者［26］。多項腫瘤標志物能提高原發(fā)性肝癌的診斷率，因此我們要通過大量試驗組合的分析，發(fā)現(xiàn)具有高敏感度和高特異度的新型腫瘤標志物用于對早期肝癌的鑒別診斷。

1 陳洪，王智，吳健.肝癌循環(huán)腫瘤細胞的研究現(xiàn)狀.臨床肝膽病雜志，2011，27:796-800.

2 韓硬海，李樹桐主編.臨床肝臟病學.第1版.山東:山東科學技術出版社，2004.471.

3 中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版).中華肝臟病雜志，2011，19:13-34.

4 中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版).臨床腫瘤學雜志，2011，16:929-944.

5 房萌，高春芳.肝細胞癌診斷標志研究與臨床應用新進展.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:212-216.

6 孫璐，劉銀坤.肝癌早期診斷標志物.國際腫瘤學雜志，2011，38:296-299.

7 羅文明，陳琳，曹亞麗，等.血清GP73及AFP-L3檢測在原發(fā)性肝癌診斷中的意義.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2013，12:1005-1009.

8 丁賢，劉樹業(yè)，周淑芬，等.甲胎蛋白異質(zhì)體在鑒別良惡性肝病中的應用價值.天津醫(yī)藥，2010，9:821-822.

9 邢卉春.甲胎蛋白異質(zhì)體檢測在原發(fā)性肝癌診療中的價值.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:123-124.

10 何建偉，曹薇薇，李靜，等.甲胎蛋白異質(zhì)體3及其比值對原發(fā)性肝癌和肝硬化的鑒別診斷價值研究.中國全科醫(yī)學，2012，15:2640-2642.

11 宋婕，李官成.肝癌相關腫瘤標志物研究新進展.國際病理科學與臨床雜志，2011，31:54-58.

12 Bruix J，Sherman M.Management of hepatocellular carcinoma:an update.Hepatology，2011，53:1020-1022.

13 宋孟锜，楊永飛，王冬冬，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和甲胎蛋白聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝癌的診斷價值.臨床肝膽病雜志，2011，27:391-393.

14 付順軍，李紹強，林杰，等.血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白測定在肝細胞癌診斷中的價值.中華普通外科學文獻(電子版)，2010，12:553-554.

15 王濤，王鳳梅，高英堂，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝穿刺活檢標本中鑒別診斷的意義.世界華人消化雜志，2011，19:693-699.

16 劉斐燁，蘇寧，梁繼珍，等.Glypican-3蛋白在肝癌患者血清中的表達及意義.山東醫(yī)藥，2010，50:55-56.

17 包永星，楊穎，趙化榮，等.高爾基體蛋白73對早期肝癌的診斷價值及臨床意義.中華腫瘤雜志，2013，35:505-508.

18 楊穎，木尼熱·馬合蘇提，包永江，等.GP73和AFP單項與聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的價值.中華檢驗醫(yī)學雜志，2012，35:1034-1037.

19 鄭昭敏，韓紹磊，杜文軍，等.血清高爾基體糖蛋白73在乙型肝炎相關性肝細胞癌早期診斷中的價值.中華實驗與臨床感染病雜志(電子版)，2011，5:459-464.

20 梁嶸，岳慧芬，朱海龍，等.GP73在原發(fā)性肝癌組織中的表達及意義.山東醫(yī)藥，2012，52:27-37.

21 Sun Y，Yang H，Mao Y，et al.Increased Golgi protein 73 expression in hepatocellular carcinoma tissue correlates with tumor aggression but not survival.J Gastroenterol Hepatol，2011.26:1207-1212.

22 熊將軍，曹陽，張雨相.多項腫瘤標志物檢測對原發(fā)性肝癌的診斷價值.檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9:157-160.

23 張宏，葉迎賓，李淑敏，等.新型腫瘤標志物用于原發(fā)性肝癌診斷的臨床研究.河北醫(yī)藥，2012，34:3218-3220.

24 黃文成，黃玲莎，王英，等.AFP、CA125和TSGF聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝癌診治中的應用.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2005，13:490-491.

25 馬桂英，劉娟，姚紅昌，等.多種腫瘤標志物對原發(fā)性肝癌的診斷價值.臨床內(nèi)科雜志，2001，18:147-149.

26 任一彬，王紅陽.肝細胞診斷標志物的研究進展.臨床肝膽病雜志，2010，26:358-360.