何宴清 楊萍 文莉 鄭雪松 肖麗

目前，糖尿病已經(jīng)成為威脅公眾健康的主要疾病之一，其最不利的并發(fā)癥是糖尿病腎病(DN)，與腎功能損害和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的臨床綜合征［1］。各種類型的糖尿病其糖尿病腎病是隨著時(shí)間逐漸進(jìn)展。最早檢測(cè)的標(biāo)志是微量白蛋白尿和組織病理學(xué)改變包括細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，腎小球基底膜增厚，腎小球系膜擴(kuò)張［2］。最后大量蛋白尿的出現(xiàn)，其次是一個(gè)漸進(jìn)的腎小球?yàn)V過(guò)率下降和腎小球足細(xì)胞的損失，腎小管間質(zhì)纖維化，腎小球硬化，小動(dòng)脈玻璃樣變。預(yù)防或阻止糖尿病腎病進(jìn)展，嚴(yán)格控制血糖和高血壓是關(guān)鍵因素［3］。然而，即使對(duì)糖尿病患者控制腎臟疾病健康教育，有相當(dāng)數(shù)量的患者不僅發(fā)展為糖尿病腎病，而且進(jìn)展為慢性腎臟病。因此，延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病將是非常必須的［4］。本研究通過(guò)測(cè)定2型糖尿病腎病患者T細(xì)胞的比例，分析在2型糖尿病腎病的發(fā)病與細(xì)胞之間的關(guān)系，明確外周血細(xì)胞在慢性腎臟性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的所起的作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為干細(xì)胞治療糖尿病深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2013年1月在我院腎病內(nèi)科住院的終末期腎病患者100例，根據(jù)是否合并糖尿病分為2組:糖尿病合并終末期腎病組55例，男30例，女25例;終末期腎病組45例，男23例，女22例，為終末期腎病無(wú)糖尿病病史。糖尿病組為50例2型糖尿病患者無(wú)腎病病史。同時(shí)選取體檢中心的60例健康體檢者作為健康對(duì)照組。4組一般資料比較有可比性。見(jiàn)表1。

表1 4組一般資料比較±s

表1 4組一般資料比較±s

組別 年齡(歲) BMI(kg/m2) 血壓(mm Hg) 膽固醇(TC，mmol/L) 三酰甘油(TG，mmol/L)糖尿病合并終末期腎病組(n=55)52 ±0.4 25 ±0.8 120/8 ±10/6 4.65 ±1.02 1.6 ±0.8終末期腎病組(n=45) 51 ±0.5 24.5 ±0.5 116/75 ±8/4 4.24 ±0.08 1.5 ±0.5糖尿病組(n=54) 49 ±0.3 25.8 ±0.7 124/75 ±9/5 5.05 ±0.07 1.6 ±0.8健康對(duì)照組(n=60) 53 ±0.2 24.6 ±0.4 118/7 ±10/6 4.95 ±0.05 1.6 ±0.6

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo):留取清晨所有被檢查者的隨機(jī)尿，并抽取空腹靜脈血，檢測(cè)TC、血肌酐(Scr)、TG、空腹血糖(Glu)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、餐后2 h血糖(2 hFPG)、留取2 ml外周血測(cè)定細(xì)胞在單核細(xì)胞中的比值等。(1)白蛋白尿:留取的尿樣應(yīng)用測(cè)尿微量白蛋白應(yīng)用氧化酶法檢測(cè)尿肌酐(Cr)。(2)腎小球?yàn)V過(guò)率估計(jì)值(eGFR):Scr(日本Hitachi)應(yīng)用氧化酶法檢測(cè)，以全國(guó)腎小球?yàn)V過(guò)率估計(jì)值課題協(xié)作組開(kāi)發(fā)的適合中國(guó)人群的改良MDRD公式計(jì)算估算腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)［ml·min－1·(1.73 m－2］=175 × (HitPcr)－1.234×(年齡)－0.179×(0.79女性)。HitPcr為用Hitachi7170分析儀檢測(cè)的血肌肝。Scr的單位為mg/dl，年齡的單位為歲，eGFR的分期參照 K/DOQI的分期標(biāo)準(zhǔn)［5］。(3)細(xì)胞測(cè)定:密度梯度離心法分離外周單一核細(xì)胞及去除幼稚紅細(xì)胞，過(guò)濾用4～5號(hào)針頭，體積稀釋用含有10%FBS的分離緩沖液。加于淋巴分離液時(shí)，試管需傾斜45°(淋巴分離液與標(biāo)本體積比為1∶2)，離心30 min后，用吸管吸取中間層，將其等體積混勻與分離緩沖液，離心20 min棄去上清液，1 ml分離緩沖液加入并混勻，紅細(xì)胞裂解液加3～5 ml，2 min裂解，離心20 min，棄紅色上清。至少1 ml加分離緩沖液再混勻。EP管中加入吸取100 ml混勻的免疫磁珠，磁力將磁珠吸附于管壁，吸去多余液體，取下后加1 ml分離緩沖液混勻，1 min吸去液體取下，再置MPC磁力架上，加分離緩沖液至磁鐵高度重懸細(xì)胞置于MPC磁力架上，在磁珠的帶動(dòng)下和磁珠結(jié)合的細(xì)胞吸附于EP管壁，吸去上清2 min后，反復(fù)3次后，并加入100 ml EDTA，渦旋2～3 s，室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)孵育45 min后，細(xì)胞與磁珠在EDTA作用下分離，置于MPC磁力架上2 min加2 ml分離緩沖液渦旋2～3 s，EP管壁被磁珠吸附，而細(xì)胞再次分布于液體中，新EP管吸取液體，MPC磁力架上反復(fù)3次后，混勻后置室溫孵育30 min，用PBS洗3遍棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮于500單位PBS中進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用非配對(duì)資料t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn);CKD相關(guān)危險(xiǎn)因素的分析采用二分類非條件Logistic回歸分析;多組資料的檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表2 4組外周血CD+34/單核細(xì)胞比值%，±s

表2 4組外周血CD+34/單核細(xì)胞比值%，±s

注:與健康對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與糖尿病組比較，#P ＜0.05

組別CD+34/PMNC健康對(duì)照組(n=60)0.094 ±0.032糖尿病組(n=50) 0.075 ±0.022*終末期腎病組(n=45) 0.038 ±0.020*#糖尿病合并終末期腎病組(n=55) 0.035±0.020*#

2.2 4組FPG、2 hFPG、HbA1c水平比較 健康對(duì)照組與糖尿病組、糖尿病合并終末期腎病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與終末期腎病組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與終末期腎病組、糖尿病合并終末期腎病組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);終末期腎病組與糖尿病合并終末期腎病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組FPG、2 hFPG和HbA1c水平比較±s

表3 4組FPG、2 hFPG和HbA1c水平比較±s

注:與健康對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與糖尿病組比較，#P ＜0.05;與終末期腎病組比較，△P ＜0.05

組別 FPG(mmol/L)2 hFPG(mmol/L) HbA1c(%)健康對(duì)照組(n=60)4.3 ±0.8 7.2 ±0.6 4.9 ±0.5糖尿病組(n=50) 8.0 ±2.1 9.8 ±2.3 8.5 ±0.6終末期腎病組(n=45) 5.7 ±1.2# 8.3 ±2.4# 5.6 ±0.9#糖尿病合并終末期腎病組(n=55) 9.5±3.0*#△ 13.6±3.6*#△ 10.5±0.7*#△

2.3 4組患者微量白蛋白、Cr、eGFR比較 終末期腎病組及糖尿病合并終末期腎病組微量白蛋白、Cr、eGFR與健康組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。糖尿病組與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，糖尿病組與終末期腎病組及2型糖尿病合并終末期腎病組微量白蛋白、Cr、eGFR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。終末期腎病組及糖尿病合并終末期腎病組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組患者微量白蛋白、Cr、eGFR比較±s

表4 4組患者微量白蛋白、Cr、eGFR比較±s

注:與健康對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 Cr(μmol/L) 微量白蛋白(mg/L) eGFR(%)健康對(duì)照組(n=60) 60±6 5.4±2.9 98±7*糖尿病組(n=50) 80±8 6.9±3.2 95±8*終末期腎病組(n=45) 795±8* 1 014.3±50.2* 9.0 ±0.8*糖尿病合并終末期腎病組(n=55) 804±10* 986.1±40.0* 9.5 ±1.2*

表5 CD34+細(xì)胞與各指標(biāo)相關(guān)分析

3 討論

糖尿病腎病是隨著時(shí)間逐漸進(jìn)展。最早檢測(cè)的標(biāo)志是微量白蛋白尿和組織病理學(xué)改變包括細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，腎小球基底膜增厚，腎小球系膜擴(kuò)張。最后大量蛋白尿的出現(xiàn)，其次是一個(gè)漸進(jìn)的腎小球?yàn)V過(guò)率下降和腎小球足細(xì)胞的損失，腎小管間質(zhì)纖維化，腎小球硬化，小動(dòng)脈玻璃樣變［6］。National等［7］分離外周血的單核細(xì)胞通過(guò)磁珠選擇法，在體外分化成內(nèi)皮細(xì)胞證實(shí)細(xì)胞是其中的一種血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，可來(lái)反映血管內(nèi)皮功能的變化通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞水平，預(yù)測(cè)血管的反應(yīng)性通過(guò)外周血的水平可以更好反應(yīng)。Zuo等［8］研究表明其預(yù)測(cè)腎臟血管內(nèi)皮功能早期損傷終末期腎病患者的細(xì)胞、黏附因子1增高、細(xì)胞均降低。Cepeda等［9］發(fā)現(xiàn)腎病患者動(dòng)員到外周血中，證實(shí)患者的血管內(nèi)皮功能可能細(xì)胞恢復(fù)作用有關(guān)。Yang等［10］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與腎病患者的免疫復(fù)合物程度呈負(fù)相關(guān)。由此推出測(cè)定細(xì)胞在腎病發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中極為重要，在治療方面，外周干細(xì)胞已被證明分化或轉(zhuǎn)分化為腎系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞［11－15］。此外，外周間充質(zhì)干細(xì)胞可能交叉生殖細(xì)胞屏障和內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞和外胚層血統(tǒng)。外周間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)組織再生，不僅因?yàn)槠浞只瘽撃?，間充質(zhì)干細(xì)胞清除氧化應(yīng)激作用［16］。外周間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的體外培養(yǎng)和電離輻射，產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激。活性氧和活性氮物種的有害影響外周間充質(zhì)干細(xì)胞的低敏感性與這些細(xì)胞的有效清除過(guò)氧化氫和過(guò)氧亞硝基陰離子的能力有關(guān)［17］。此外，外周間充質(zhì)干細(xì)胞具有解毒酶活性物種的主要機(jī)制，防止氧化損傷的蛋白質(zhì)組和基因組間充質(zhì)干細(xì)胞在正常周轉(zhuǎn)和包括腎血管腎結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［17－20］。

本文對(duì)60例健康者，50例2型糖尿病患者，55例2型糖尿病患者合并終末期腎病患者及45例終末期腎病患者進(jìn)行了對(duì)比研究，得出2型糖尿病患者外周血水平低于健康對(duì)照組，這可能與2型糖尿病患者血管病變有關(guān)。終末期腎病患者外周血細(xì)胞與單核細(xì)胞的比值低于健康對(duì)照組，表明的水平可以作為血管反應(yīng)性的一個(gè)預(yù)測(cè)因子;2型糖尿病合并終末期腎病患者外周血水平與終末期腎病組差異無(wú)顯著性意義，表明在腎臟疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮功能紊亂起到很重要的作用，本文結(jié)果表明外周血中/PMNC值與2型糖尿病合并終末期腎病的危險(xiǎn)因素密切相關(guān):外周血值與FPG、2 h FPG及 HbA1c呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。表明細(xì)胞與血糖波動(dòng)密切相關(guān)，血糖波動(dòng)可能影響細(xì)胞的變化，從而可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能的紊亂，加重血管病變。本文還證實(shí)尿微量白蛋白及肌酐水平是值的影響因素之一(P＜0.05),細(xì)胞可能是終末期腎病的危險(xiǎn)因素受到影響從而參與 腎病的發(fā)生及發(fā)展，監(jiān)測(cè)細(xì)胞水平的變化也許可以用來(lái)預(yù)測(cè)2型糖尿病合并腎病發(fā)生。同時(shí)觀察細(xì)胞在慢性腎臟性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的所起的作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為干細(xì)胞治療糖尿病深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 Garg AX，Kibexd BA，Clark WF，et al.Albuminufia and renalinsufficiency prevalence guides population screening:results from the NHANESIII.Kindney Int，2002，61:2165-2175.

2 Coresh J，Selvin E，Stevens LA，et al.Prevalence of chronic kidney disease in the United States.JAMA，2007，298:2038-2047.

3 Chadban SJ，Briganti EM，Kerr PG，et al.Prevalence of kidney damage in Australian adults:the AusDiab kidney study.J Am Soc Nephrol，2003，14:S131-138.

4 Kunitoshi I，Kentaro K，Atsushi S，et al.Changes in the demographics and prevalence of chronic kidney disease in Okinawa.Japan(1993 to 2003).Hypertens Res，2007，30:55-62.

5 Xue JL，Ma JZ，Louis TA，et al.Forecast of the number of patientswith end-stage renal disease in the United States to the year 2010.JAm Soc Nephrol，2001，12:2753-2758.

6 Ati AS，Remuzzi G.Chronic renal diseases as a public health problem:Epidemiology，social，and economic implications.Kidney Int，2005，68:7-10.

7 National Kidney Foundation.K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease:evaluation，classification and stratification.Am J Kidney Dis，2002，39:S1-S266.

8 Zuo L，Ma CHY，Wang M，et al.Appfieation of glomerular filtration rate estimating equations in chinses with chronic kidneydisease.Am J Kidney Dis，2005，45:463-472.

9 Cepeda FJ，F(xiàn)ernandez E，Pobes A，et al.Utility of cystatin-C in hospitalized patients.Comparing with diferent methods of assessing renal function.Nefrologia，2007，27:168-174.

10 Yang YS，Peng CH，Liu CK，et al.Use of serum eystatin C to detect Early-decline of glomerular filtration rate in type 2 diabetes.Intern Med，2007，46:801-806.

11 Hooligan CA，Tsalam an dris C，Akdeniz A，et al.Albumin to ereatinine ratio:a screening test with limirations.Am J Ki dneyDis，2002，39:1183-1189.

12 Skalova S.The diagnostic role of urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase(NAG)activity in the detection of renal tubular impairment.Acta Medica(Hradec Kralove)，2005，48:75-80.

13 Sawshima K，Mizuno S，Mizuno HY，et al.Protein restriction ameliorates renaltubulointerstitial nephritis and reducesrenal transforming groeth factor beta expression in unilateraluretral obstruction.Exp Nephro1，2002，10:7-18.

14 Prakash S，Pande DP，Shanna S，et al.Randomized，double-blind，place-bo-controlled trial to evaluate efficacy of keto dietin predialytic chlonic renal failure.J Ren Nutr，2004，14:89-96.

15 Giordano M，De Feo P，Lucidi P.Effects of dietary protein restriction on fibrinogen and albumin metabolism in ne-phritic patients.Kidney Int，2001，60:235-242.

16 Kaplan NM.Kaplan’s-clinical hypertension 9th ed.Lippincott Wilkins.2006.373.

17 Fair DE，Ogbem MR，Weiler HA，et al.Dietary soy protein attenuates renal disease progression after 1 and 3 weeks in Han:SPRD-cy weaning rats.Nutr，2004，134:1504-1507.

18 Jamerson K，Weker MA，Bakris GL，et al.Benazepril plus amlodipine or hydrochlorothiazide for hypertension in high-risk patients.Engl J of Med，2008，359:2417-2428.

19 KDOQL Clinical Practice Guidelines and Clinical Practice Recommendations for Diabetes and Chronic Kidney Disease.Am J Kidney Dis，2007，49(2 Suppl 2):S12-154.

20 Dasgupta I，Porter C，Innes A，et al.“Benign”hypertensive nephrosclerosis.QJM，2007，100:113-119.