陳秋平，胥思勤

（貴州大學(xué)喀斯特環(huán)境與地質(zhì)災(zāi)害防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550003）

稀脈萍對水中甲基橙的毒害響應(yīng)及去除研究

陳秋平，胥思勤

（貴州大學(xué)喀斯特環(huán)境與地質(zhì)災(zāi)害防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550003）

用甲基橙作為脅迫因子，研究了甲基橙對稀脈萍葉片過氧化物酶活性、可溶性蛋白含量和葉綠素含量的影響，并采用稀脈萍去除甲基橙。結(jié)果表明：隨著甲基橙濃度的增加，過氧化物酶活性呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)甲基橙濃度為140mg／L時，過氧化物酶活性達(dá)到最高值。當(dāng)甲基橙濃度 ＞100mg／L，可溶性蛋白含量急速下降。葉綠素含量和葉綠素 a／b比值均隨甲基橙濃度的升高而降低。當(dāng)甲基橙濃度為20mg／L時，稀脈萍對甲基橙的去除需經(jīng)10d的延滯期，24 d后去除率達(dá)89.6%。

甲基橙；稀脈萍；毒性；去除；研究

浮萍科植物 （以下簡稱浮萍）作為小型的水生單子葉植物，在植物毒性評價試驗(yàn)中具有很多優(yōu)勢［1］，這不僅是由浮萍本身生物學(xué)特點(diǎn)所決定的，也是由長久以來利用浮萍作為生態(tài)毒理學(xué)研究的模式材料，積累了大量有關(guān)的生態(tài)毒理學(xué)信息所決定的［2］。浮萍能分解、吸收、轉(zhuǎn)化氮和磷以及有機(jī)物等營養(yǎng)物質(zhì)，具有優(yōu)越的生長性能和廣泛的用途，因此采用浮萍處理污水已成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［3］。

稀脈萍，又稱稀脈浮萍，葉狀體自由漂浮在水表面，2～8個連在一起形成群體，主要進(jìn)行營養(yǎng)繁殖，在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)時1—4d即可翻番，是我國分布最廣、最常見的浮萍屬種類［2］。

甲基橙是一種互變異構(gòu)體，在酸性和堿性條件下的偶氮和醌式結(jié)構(gòu)是染料化合物的主體結(jié)構(gòu)，因此以其作為染料模型化合物具有一定的代表性［4］。尹紅霞等［5］采用電化學(xué)催化氧化法降解水中甲基橙，Wen等［6］采用納米二氧化鈦光催化降解甲基橙，王曉燕等［7］利用海綿鐵還原耦合活性炭吸附－微波再生技術(shù)降解甲基橙。稀脈萍對水中甲基橙的毒害響應(yīng)及去除研究尚未見報(bào)道。本文以過氧化物酶活性、可溶性蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量等為指標(biāo)，研究稀脈萍對甲基橙的毒理學(xué)響應(yīng)，探討稀脈萍去除水中甲基橙廢水的可能性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：UV－3200PCS紫外可見分光光度計(jì)；Sartorius電子天平；PYX－250s－B生化培養(yǎng)箱；Sartorius PB－10酸度計(jì)；SHA－B恒溫振蕩器；TGL－16G臺式離心機(jī)；CS101－33EB型電熱鼓風(fēng)烘干箱。

試劑：甲 基橙 （上海 試 劑 三 廠 生產(chǎn)），K2HPO4、MgSO4、KNO3、Ca（NO3）2、80%丙酮、愈創(chuàng)木酚、30%H2O2、Na2CO3、NaOH、CuSO4· 5H2O、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、硫酸鋰。以上藥品均為分析純。

1.2 稀脈萍的采集與培養(yǎng)

從九龍江附近魚塘采集稀脈萍 （Lemna aequinoctialis），選擇個體健壯、葉片完好的植株用自來水沖洗3遍，置于加有 Hoagland培養(yǎng)液的搪瓷盤中預(yù)培養(yǎng)7d，培養(yǎng)溫度為25℃，光強(qiáng)4000lx，光照時間12h。隔天向盤內(nèi)添加 Hoagland培養(yǎng)液以保持液面高度。培養(yǎng)后的浮萍作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.3 方法

1.3.1 甲基橙對稀脈萍的損傷

（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以 Hoagland培養(yǎng)液為稀釋液，配制甲基橙濃度分別為 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180mg／L的溶液作為培養(yǎng)液。毒性實(shí)驗(yàn)在150ml燒杯中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)期間不更換培養(yǎng)液，在生化培養(yǎng)箱中 （培養(yǎng)溫度 25℃，光強(qiáng)4000lx，光照時間12h）培養(yǎng)72h，每個濃度重復(fù)3次，每個重復(fù)稀脈萍的初始植物體數(shù)為60。

（2）酶液的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，隨機(jī)選擇一定數(shù)量的稀脈萍葉片，洗凈、吸干水分并稱重，加入預(yù)冷的3ml 0.05 mol／L磷酸鹽緩沖液 （pH＝7.5），在冰浴中勻漿，勻漿液移入10ml離心管中，用緩沖液清洗勻漿器，將清洗液并入離心管，定容至5ml，在4000r／min離心10min，取上清液于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）過氧化物酶活性 （POD）測定

取光徑1cm比色皿2個，于一個中加入2.4ml反應(yīng)混合液［8］和0.6ml磷酸鹽緩沖液作參比；另一個中加入2.4ml反應(yīng)混合液和 0.6ml上述酶液，立即開啟秒表計(jì)時，于470nm處測量吸光度，每隔1min讀一次吸光度，每份樣品測 3min，計(jì)算 POD活性。

式中：N0－POD活性，U／g；A470－3－3 min時470 nm處吸光度；A470－0－470 nm處初始吸光度；t－時間，min；G－稀脈萍葉片鮮重，g。

（4）可溶性蛋白含量的測定

采用Folin酚法［8］測定可溶性蛋白含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在620nm處測定。

樣品中蛋白含量 （mg／g）＝C×VT／（V×W× 1000）

式中：C－查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg；VT－提取液總體積，ml；V－測定時加樣量，ml；W－稀脈萍葉片鮮重，g。

（5）葉綠素含量測定

將剩余的稀脈萍洗凈、吸干水分并稱重，加入少量的 CaCO3粉末和 80%丙酮進(jìn)行研磨，充分勻漿。勻漿液移入 10ml離心管，用80%丙酮洗滌勻漿器，清洗液并入離心管，定容至5ml，4℃放置24 h后，4000r／min離心 10min，以80%丙酮為參比，取上清液于645nm、663nm處測定吸光度。

按公式①、②、③［9］計(jì)算葉綠素 a、b和總濃度：

式中：Ca－葉綠素 a的濃度，mg／L；Cb－葉綠素b的 濃 度，mg／L；C總－葉 綠 素 總 濃 度，mg／L。

按公式④計(jì)算葉綠素的含量：

式中：C總－葉綠素濃度，mg／L；V－提取液總體積，ml；A－取樣鮮重，g。

1.3.2 稀脈萍對甲基橙的去除

挑選生長健壯、葉片完好、長勢相同的植物體，先用蒸餾水沖洗（不損傷根系）、風(fēng)干 （5～10min）、稱重，放入直徑25cm、高20cm的塑料盆中，每盆加入初始濃度為 20 mg／L的甲基橙廢水5L，同時設(shè)置對照組，用不透光的黑紙覆蓋，覆蓋面積與稀脈萍覆蓋面積相同。對所有塑料盆的外側(cè)也用黑紙遮蓋，使之與天然水體光照情況接近?？紤]到水的自然蒸發(fā)和浮萍的蒸騰作用，試驗(yàn)在每次測定培養(yǎng)液中甲基橙殘留濃度時稱水量，這樣可以避免水的添加致使污染物被人為稀釋，使植物的吸收行為可能發(fā)生變化。通過稱水量，換算所觀測指標(biāo)的總量來計(jì)算去除率，使本試驗(yàn)的去除效果與自然狀態(tài)更為符合。甲基橙的測定方法參照文獻(xiàn)［5，10］。去除率的計(jì)算公式為：

式中：C0－培養(yǎng)液中甲基橙的初始濃度；V0－培養(yǎng)液的初始體積；Ci－第 i天培養(yǎng)液中甲基橙的殘留濃度；Vi－第 i天培養(yǎng)液的體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基橙對稀脈萍的損傷

2.1.1 POD活性

三組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值分析。甲基橙對稀脈萍POD活性的影響見圖1。從圖1可見，隨甲基橙濃度的增加，POD活性總體上呈先上升后下降的趨勢，且最高濃度組的 POD活性仍高于對照組。當(dāng)甲基橙濃度為140 mg／L，POD活性出現(xiàn)最高值。

POD是植物適應(yīng)多種逆境脅迫的重要保護(hù)酶之一，在一定的污染濃度范圍內(nèi)，酶活性得以維持或提高，超過這個范圍，活性下降［11］。由于甲基橙的存在，導(dǎo)致稀脈萍通過一系列生理生化反應(yīng)產(chǎn)生了對自身有害的過氧化物，隨著這種物質(zhì)的增加，POD利用 H2O2來催化這些對自身有害的過氧化物的氧化分解，因此，隨植物體內(nèi)這些POD底物濃度的增加，致使 POD活性上升。而當(dāng)處理濃度進(jìn)一步增加，有毒有害物質(zhì)超過 POD正常的催化能力后，導(dǎo)致其活性下降。許多研究還表明，POD－H2O2分解系統(tǒng)參與了葉綠素的降解［12］，并且POD活性與葉綠素含量呈高度負(fù)相關(guān)［13］。本實(shí)驗(yàn)中，隨著甲基橙濃度的增加，POD活性逐漸增加，葉綠素含量減少 （圖3），葉綠素a／b值減小，這也說明甲基橙通過 POD活性增加直接或間接地影響葉綠素的降解。

2.1.2 可溶性蛋白含量

隨著甲基橙濃度的增大，可溶性蛋白含量呈下降趨勢 （見圖 2），特別是甲基橙濃度 ＞100 mg／L之后呈急速下降的趨勢。當(dāng)甲基橙濃度為180mg／L，處理3d后稀脈萍可溶性蛋白含量降到最低，比對照組降低了44.7%。由此可見，甲基橙污染可引起可溶性蛋白持續(xù)下降，可能是甲基橙引起蛋白變性，也可能是酶蛋白失活或DNA翻譯轉(zhuǎn)錄途徑受阻，影響了蛋白質(zhì)的合成。甲基橙污染在抑制新蛋白質(zhì)合成的同時，也可能加強(qiáng)了原有蛋白質(zhì)的分解。

2.1.3 葉綠素含量及葉綠素 a／b值

稀脈萍葉片中葉綠素a（Chl.a）、葉綠素 b （Chl.b）和葉綠素總量 ［Chl.（a＋b）］均隨甲基橙濃度的升高而降低（見圖3）。當(dāng)甲基橙濃度為180 mg／L，處理3d后 Chl.a、Chl.b和Chl.（a＋b）均降到最低，分別比對照組降低了60.3%、33.3%和50.5%。葉綠素 a／b值總體上隨甲基橙濃度的增加而逐漸減?。ㄒ妶D4）。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的色素，葉綠素含量和組分是影響光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素含量低，光合作用弱，會導(dǎo)致植物鮮重降低，使植物不能正常新陳代謝［11］。葉綠素含量減少是衡量葉片衰老重要的生理指標(biāo)［14］。Woolhouse［15］認(rèn)為隨著葉片的衰老，葉綠素含量逐漸下降，葉綠素a比葉綠素b下降得更快，葉綠素 a／b比值可作為葉片衰老的指標(biāo)。在本研究中，葉綠素含量及葉綠素a／b比值隨著甲基橙濃度的增加而減少，這說明甲基橙能加速稀脈萍葉片老化。

2.2 稀脈萍對甲基橙的去除

利用浮萍治理受污染水體有很多其他治理方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，所以無論是在廢水的處理上還是在水體的生態(tài)恢復(fù)上，利用浮萍來處理受污染水體已引起人們的關(guān)注［16，17］。在上述毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取甲基橙初始濃度為20 mg／L來探討稀脈萍對甲基橙的去除情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖 5可見，稀脈萍對甲基橙的去除需要經(jīng)過 10d的延滯期，然后進(jìn)入加速去除階段，18d、20d和 24d的去除率分別達(dá)40%、55.2%和89.6%。10d的延滯期可能是稀脈萍對甲基橙水溶液的適應(yīng)期，但顯然，可以采用稀脈萍來去除甲基橙。關(guān)于溫度、光照、pH值等環(huán)境條件對稀脈萍去除甲基橙的影響以及稀脈萍去除甲基橙的機(jī)理，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

（1）隨著甲基橙濃度的增加，稀脈萍葉片的POD活性總體上呈先上升后下降的趨勢，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，葉綠素 a、葉綠素 b、葉綠素總量、a／b值均呈下降趨勢。

（2）稀脈萍對甲基橙的去除需要經(jīng)過 10 d的延滯期，24 d后去除率達(dá)89.6%。

［1］宋志慧，黃國蘭.浮萍在水生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用 ［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2005，28（1）：94－96.

［2］李天煌.稀脈萍 （Lemna aequinoctialis）和紫萍 （Spirodela Polyrrhiza）的重金屬生態(tài)毒理學(xué)研究 ［D］.武漢：武漢大學(xué)，2003.

［3］Bergman B A，Cheng J，Classen J，et al.Nutrient removal from swine lagoon effluent by duckweed［J］.Transactions of the American Society of Agricultural Engineering，2000，42（2）：263 －269.

［4］王怡中.甲基橙溶液多相光催化降解研究 ［J］.環(huán)境科學(xué)，1998，19（1）：1－4.

［5］尹紅霞，康天放，張雁，等.電化學(xué)催化氧化法降解水中甲基橙的研究 ［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31（2）：88－91.

［6］Wenxi Guo，F(xiàn)ang Zhang，Changjian Li，et al.Direct Growth of TiO2Nanosheet Arrays on Carbon Fibers for Highly Effi－cient Photocatalytic Degradation of Methyl Orange［J］.Adv.Mater，2012，（24）：4761－4764.

［7］王曉燕，許振成，劉蕓，等.海綿鐵還原耦合活性炭吸附 －微波再生技術(shù)降解甲基橙 ［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2013，7 （6）：2093－2098.

［8］袁曉華，楊中漢.植物生理生化實(shí)驗(yàn) ［M］.北京：高等教育出版社，1983.

［9］葛瀅，王曉月，常杰，等.不同程度富營養(yǎng)化水中植物凈化能力比較研究 ［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1999，19（6）：690 －692.

［10］季民，張宏偉，楊秀文.染料廢水混凝脫色與氧化脫色的最佳條件 ［J］.環(huán)境工程，1994，12（1）：3－6.

［11］劉娥，張建，魏榕，等.有機(jī)污染脅迫對人工濕地中浮萍抗氧化系統(tǒng)的影響 ［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2013，7（9）：3296 －3330.

［12］徐楠.汞鎘及其復(fù)合污染對浮萍的毒害影響及細(xì)胞凋亡機(jī)制的初探［D］.南京：南京師范大學(xué)，2003.

［13］尹永強(qiáng)，胡建斌，鄧建軍.植物葉片抗氧化系統(tǒng)及其對逆境脅迫的響應(yīng)研究進(jìn)展 ［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（1）：105－110.

［14］任安芝，高玉葆，劉爽.鉻、鎘、鉛脅迫對青菜葉片幾種生理生化指標(biāo)的影響 ［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6 （2）：112－116.

［15］Woolhouse H W.Longevity and senescence in plant［J］.Sci Prog Oxford，1974，（61）：23－24.

［16］Caicedo J R，Van Der Steen N P，Arce O，et al.Effect of total ammonia nitrogen concentration and pH on growth rates of duckweed（Spirodela polyrrhiza）［J］.Water Res，2000，34（5）：3829－3834.

［17］辛靜，張震，錢曉晴，等.浮萍去除污水處理廠出水中氮磷的比較研究 ［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（11）：100 －103.

［18］Ya Yang，Hulin Zhang，Sangmin Lee，et al.Hybrid Energy Cell for Degradation of Methyl Orange by Self－Powered Electrocatalytic Oxidation［J］.Nano letters，2013，（13）：803－808.

Study on Toxic Response of Lemna Aequinoctialis to Methyl Orange and Removal of Methyl Orange

CHEN Qiu－ping，XU Si－qin
（Key Laboratory of Karst Environment and Geohazard Prevention，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550003 China）

Methyl orange was used as an environmental stress factor to examine the effects on enzyme activity of peroxidase，content of soluble protein，and chlorophyll content of Lemna aequinoctialis leaves.L.aequinoctialis was applied to removal Methyl orange.The results showed that enzyme activity of peroxidase rised first and then fell with the increase of Methyl orange concentration.When Methyl orange concentration was 140 mg／L，enzyme activity of peroxidase came to the maximum.When Methyl orange concentration was more than 100 mg／L，soluble protein content dropped rapidly.The chlorophyll content and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b decreased with the increase of Methyl orange concentration.When Methyl orange concentration was 20 mg／L，there was a 10－day lag period.Then the degradation rate of Methyl orange could reach 89.6%after L.aequinoctialis was cultured 24 days.

Methyl orange；Lemna aequinoctialis；toxicity；removal；study

X131.2

A

1673－9655（2014）04－0059－04

2014－02－28

陳秋平 （1986－），男，碩士研究生，主要從事環(huán)境工程方面研究。

胥思勤，女，副教授，博士后，碩士生導(dǎo)師。