何鐵光， 楊雯馨， 林崇寶， 何永群，張 野， 韋彩會， 李婷婷

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧530007;2.沅渼生物科技股份有限公司，中國 臺灣42057)

在糧食增產(chǎn)的壓力下，化學肥料與農(nóng)藥被大量使用，造成環(huán)境遭受極大壓力，如環(huán)境激素問題、水體富營養(yǎng)化問題等，不僅造成環(huán)境污染、生態(tài)破壞，最后也會經(jīng)食物鏈造成食品安全等問題，使人類健康遭受威脅，如生長發(fā)育問題，并造成種種社會問題.而有機農(nóng)業(yè)所追求的是與自然界達成平衡，利用生物性的制劑逐步替代化學性的制劑已成為近代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向. 因此，好的微生物制劑具有多重功效，如植物保護、促進開根、增加植物抗性基因的表達、生長因子的分泌、促進植物對營養(yǎng)源的吸收、改善重金屬及化學有機物多環(huán)芳香族的污染問題.而植物病害產(chǎn)生的原因大多起因于土壤問題，如病原菌持續(xù)留存在土壤中，致使農(nóng)作物在輪作時造成植物的再次放大與感染，細究其主因是生物相的不平衡，在易受病害的土中其微生物相對而言較為單純. 而這些土壤的微生物具有溶磷作用、固氮作用、增強植物抗病、增強營養(yǎng)吸收等作用，因此，一般稱為促進植物生長根圈細菌(PGPR)［1］.這些土壤菌與植物根系形成生物圈，共同經(jīng)營生存環(huán)境，如分泌水解酵素，提升磷及氮、鉀、鐵溶解性，幫助植物吸收微量元素，此外透過植物根部的誘導，植物體啟動防御機制，表現(xiàn)抗性基因，如經(jīng)NPR1 途徑經(jīng)SAR 或ISR 誘發(fā)PR1a、Gns1 (1，3;1，4-β-glucanase)、Cht-1 (chitinase)、PR4、PR5 和PR10a、PPO等基因的表現(xiàn)造成全株植物產(chǎn)生抗性抵御病原入侵［2，3］.另外植物根圈微生物的建立可降低土壤中病原菌數(shù)量，在植物根圈的微生物可促進植物產(chǎn)生抗性，增加植物的免疫能力，此種抗性為系統(tǒng)性的，亦稱為誘發(fā)性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)［3］，如Bacillus pumilus、Bacillus mycoides. 而從植物根圈所篩出的微生物，可有效的防治真菌、線蟲、病毒、昆蟲及細菌等危害.發(fā)展多功效的PGPR，及找出最適植物的配方，是有機農(nóng)業(yè)發(fā)展上的較佳解決之道，因此，最好的方式是對生態(tài)有所認知，利用永續(xù)農(nóng)業(yè)(sustainable agriculture)的觀念進行作物培育.其中，有機農(nóng)業(yè)(organic farming)是最好的方法，透過天然的方式進行作物培育，利用有機質(zhì)肥料，不使用化學性的肥料、農(nóng)藥、生長調(diào)節(jié)劑，改用生物性的肥料、農(nóng)藥、生長調(diào)節(jié)劑，并配合如輪作、間作等耕作方式，進行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)管理，以達純凈農(nóng)業(yè)的目的.已知這些PGPR 可增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，如促進作物之發(fā)芽、或是作物的生長及提升產(chǎn)，目前在一些研究中已獲得成果，例如糧食作物:水稻、花生、小麥、大豆、玉米;根莖類作物:馬鈴薯、甜菜及蘿卜等;葉菜類作物:油菜、小白菜;水果類作物西紅柿等農(nóng)作物［4，5］. 此外，PGPR 若能產(chǎn)生抗性物質(zhì)則稱為Antibiosis-Biological Control Agent (BCA)，可抑制病原菌生長［6］. 而除抗生素外，這些微生物會和病原菌競爭鐵離子、糖類及其它孢子萌發(fā)所需的物質(zhì)，并占據(jù)空間或捕食，如木霉菌的寄生作用、枯草菌可穿透線蟲. PGPR 微生物亦可改變植物的生理功能，如蒸散作用、營養(yǎng)吸收、固氮作用、影響荷爾蒙的產(chǎn)生等.而大多數(shù)與植物共存的PGPR，其生理功能是屬于多重機制所造成的影響，PGPR 常見的屬為Achromobacter、Arthrobacter、Azospirillum、Azotobacter、Bacillus、Burkholderia、Clostridum、Hydrogenophaga、Microbacterium、Paenibacillus、Serratia、Staphylococcus 及Streptomyces［1］. 近年來，因高速定序發(fā)展快速，使得對土壤中的菌群的研究得以進一步的得知其細菌群的量及其基因表現(xiàn)的情形，可較清楚了解不同植物根圈中微生物相的變化，藉此可更清楚了解植物的生長特性與微生物互動的情形，更可經(jīng)由transcriptome 來了解PGPR 在植物中扮演的角色，微生物如何透過植物上的受體達到促進植物生長的效果，此外可經(jīng)由基因體定序，分析主要的PGPR 物種上的基因序列，如Bacillus sp. 經(jīng)基因體定序后可得知其與植物體互動的基因［7］.

PGPR 微生物是近代有機農(nóng)業(yè)的一項重要變革，然而，要考慮的是微生物本身在大量使用下或許會對生態(tài)造成沖擊，因此合適的配方與合適的使用才能不致造成環(huán)境污染. 而PGPR 微生物的特點是針對特定植物群有專一性，因此當植物改變時，PGPR 在土壤的優(yōu)勢會消失，微生物對生態(tài)產(chǎn)生的沖擊會很小，所以，針對植物的生長特性開發(fā)適合的微生物制劑日顯重要. 在市場上，針對不同的植物營養(yǎng)源可分為固氮菌、溶磷菌、生長調(diào)節(jié)劑等需求，此外，一些真菌類的土壤制劑在市場上亦可見到，如木霉菌、白僵菌、黑僵菌，木霉菌同時兼具生物防治及溶磷作用［8］，白僵菌及外生菌根菌、蟲生真菌亦具有溶磷作用［9］，在使用時可減少病害外，同時可調(diào)節(jié)土壤中的磷肥. 而大多數(shù)的微生物可分泌一些聚合物如β-葡聚醣、γ-聚麩胺酸等物質(zhì)，可提高土壤保水性. 此外，微生物所產(chǎn)生的有機酸可中和土壤，并可緩慢釋出離子、提高營養(yǎng)元素的可利用率，不致使營養(yǎng)源流失，如Pseudomonas sp.可分泌lipopolysaccharide［10］，而Bacillus sp. 可分泌γ-聚麩胺酸［11］.生物性肥料，其肥效高低，除了菌種本身的能力外，菌種配方與組成也是關(guān)鍵因素之一，特別是多種菌株的有效組合，及其在環(huán)境中的生長與植物的互動，是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)值的關(guān)鍵技術(shù)［12］.

1 PGPR 的應用

PGPR 可視為有益微生物，而這些生物種類多元，如Azotobacter、Azomonas、Beijerinckia、Derxia 和Rhizobium 為常見的非共生型固氮菌.固氮菌可分為共生、附著及游離三種，固氮菌可減少氮肥的使用，可將空氣中的氮以nitrogenase 催化銨態(tài)氮源;此外，一些光合菌及好氣菌藍綠藻，亦具有nitrogenase，可提高土壤中的氮肥，如Anabaena、Gloeothece、Nostoc、Oscillatoria、Rhodopseudomonas、Synechococcous、Rhodospirillum、Chlorobium 和Chromatium 等屬的微生物，可進行光合作用固氮作用，減少對氮肥的依賴.磷肥在使用后會流失在土壤中，大部分的磷元素與土壤中的鈣、鎂、鋁、鐵結(jié)合后呈現(xiàn)不溶形態(tài)的復合物，而PGPR 中有許多物種可產(chǎn)生有機酸或離子嵌合劑，將土壤中存在的磷酸鋁、磷酸胺鎂、磷酸鈣及磷酸鐵等磷酸復合體溶解，經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化為有機磷，提供植物營養(yǎng).常見的菌屬如Achromobacter、Aerobacter、Alcaligenes、Azotobacter、Bacillus、Beijerinckia、Bradyrhizobium、Brevibacterium、Erwinia、Flavobacterium、Micrococcus、Nitrosomonas、Pseudomonas 和Xanthomonas.這些PGPR 微生物常由健康植株中的土壤環(huán)境所篩選，制劑中含有促進植物生長的活性微生物體或孢子，而制劑的配方可混合細菌、放線細菌、真菌、光合細菌及其發(fā)酵代謝產(chǎn)物等所制成的生物制劑.

此外，如放線菌、真菌等，亦有相當多的屬種可作為PGPR 微生物. 這些微生物除具有生物肥料能力外，亦具有保護植物的多種機制，如Pseudomonas所具有的脂多醣可誘發(fā)植物的抗病能力;而Bacillus可分泌拮抗物質(zhì)如fengycin、surfactin 可抗真菌. 而PGPR 在具有拮抗病害能力的有些菌種也同時具有生物性肥料的功能，PGPR 拮抗的病原菌可包括Erwinia chrysanthemi 、Ralstonia solanacearum 、Xanthomonas campestris pv. Vesicotoria［15］、Xanthomonas campestris pv. Campestris［16］、Xanthomonas campestris pv.Citri［17］等.PGPR 可作為良好的生物防治用藥［18］，保護植物不受病菌的侵襲，可歸于下列幾項因素:抗生物質(zhì)的作用、誘發(fā)植物抗病性、競爭作用、營養(yǎng)源限制等因素. 如:pyochelin［19］作為鐵離子嵌合劑可限制其它微生物生長;pyocyanin［20］、butyrolactones、kanosamine、DAPG、phenazine-1-carboxyclic acid、2，4-diacetyl phloroglucinol、oomycin、pyoluteorin、pyrrolnitrin、zwittermycin-A、pantocin 等可作為抗生物質(zhì);其它如N-acyl-L-homoserine lactones(AHL)，可作為植物的抗性誘發(fā)劑［21］. 有些PGPR在植物根圈的微生物相可經(jīng)產(chǎn)生激素，如IAA/cytokin 來促進植物發(fā)育;也有微生物可產(chǎn)生水解酵素，如蛋白酶、脂肪分解酶、纖維素酶及核酸分解酶，分解大分子化合物;此外PGPR 可產(chǎn)生有機酸中和土壤中的離子營養(yǎng)源或亦可將營養(yǎng)物質(zhì)在菌群中消長，達到延長營養(yǎng)素在土中的停留期，協(xié)助植物獲取養(yǎng)分;另外亦有的菌群會分泌抗性物質(zhì)，降低病原菌危害. 在植物的根圈，大多數(shù)微生物透過吸附、固定在植物體上，亦有與植物形成共生等方式，如內(nèi)生菌的方式，產(chǎn)生特定物質(zhì)，促進植物生長.

人類的生活富足后，所追求的是永續(xù)，加上健康及環(huán)保意識抬頭，有機農(nóng)業(yè)成為重要的一環(huán)，而有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)量低，若不使用農(nóng)藥肥料，收成相當有限.而在環(huán)境中有許多有用的微生物，這些微生物可取代化學性肥料，作為生物性肥料(Biofertilizer)［22］. 微生物制劑的生物肥料，可施用在種子、幼苗或土壤等，可增進土壤營養(yǎng)狀況或改良土壤之理化、生物性質(zhì)，協(xié)助植物吸收營養(yǎng)，改善農(nóng)作物抗性，增加產(chǎn)量及提升質(zhì)量. 而生物性肥料的使用與生物技術(shù)的應用有重大的關(guān)聯(lián)性，因此將傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)提升成為生技產(chǎn)業(yè)中重要的一環(huán). 生物肥料所使用的生物技術(shù)主要有菌種的分子鑒定，技術(shù)包括16S DNA 序列分析、16S-23S ITS 序列、DDGE、qPCR、RAPD、SSCP、TGGE、T-RFLP 及次世代基因體定序等技術(shù)(NGS).因PGPR 的組成復雜，而過去的研究是將菌種一一分離進行比對，在菌種回接后亦只能對1 至數(shù)種的微生物進行研究，在NGS 基因定序技術(shù)開發(fā)后，在一次實驗中可定出10 萬到百萬的序列，而若以16S 基因序列中的V6 區(qū)域來定序，此區(qū)域是菌種的指針區(qū)，土壤中的細菌約1 千種，NGS的定序能力遠遠大于菌種的數(shù)量，可利用NGS 的技術(shù)分離及研究土壤中的主要菌群，作為PGPR 組成設計的參考，針對不同植物設計最適菌調(diào)整配方，此外NGS 亦可快速了解土壤中菌群的組成，有利于新菌種的開發(fā).

2 結(jié) 論

PGPR 是透過對自然生態(tài)的了解所開發(fā)出的產(chǎn)品，以微生物肥料作為肥料，此肥料可和植物體互動，因在有益微生物環(huán)境下可培育出良好的有機農(nóng)作物，大多數(shù)的有益微生物其群落的成長和代謝與植物體呈現(xiàn)正相關(guān)，即良好發(fā)育的PGPR 會造就植物成長的良好培育環(huán)境.與化學肥料不同的是，PGPR 是以生命型式作為有效性的基礎，化學肥料是以氮、磷、鉀的元素為基礎. PGPR 對有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著重要的作用，包括土壤養(yǎng)分供應、植物生長的促進、抗病、抗逆性、改善農(nóng)產(chǎn)品特性等.PGPR 可協(xié)助改良植物的土壤環(huán)境，抑制病原菌與植物體的互動，而配方組合會影響植物的成長，良好的菌種配方，包括菌種組成、活性、使用方法及時機，除了與植物體的互動外，菌種與土壤的互動也很重要. 而這些PGPR 產(chǎn)生的植物荷爾蒙如IAA［23］，cytokinin［24］或Gibberellin［25］能促使植物根系發(fā)育. 而PGPR 也成為一項研究重點，如在植物抗性基因的表達，在模式植物擬南芥的研究中，探討PGPR 的表現(xiàn)情形，認為PGPR 從根部所誘發(fā)的基因表現(xiàn)在PR-1a 具有顯著性，其中所表現(xiàn)的基因多屬誘發(fā)型的抗性基因及訊號傳遞基因，特別是與SAR 及ISR 基因相關(guān)的表現(xiàn). 未來，可透過NGS 的技術(shù)更清楚了解PGPR 誘發(fā)植物抗性的主因，便可具有好的標準進行菌株、配方的評估與檢測. 有機農(nóng)業(yè)是農(nóng)業(yè)永續(xù)經(jīng)營的最好的方式，而PGPR 植物根圈細菌可降低農(nóng)藥的使用，并維持植物健康的生長環(huán)境，這些根圈細菌可產(chǎn)生許多互動因子如促進植物生長、營養(yǎng)吸收、誘發(fā)植物抗病及平衡環(huán)境營養(yǎng)源，而正確及適當?shù)氖褂貌挪粫斐缮鷳B(tài)的污染及危害.

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