侯曉梅，張敏，楊海龍，*

（1.溫州市質量技術監(jiān)督檢測院，浙江溫州325000；2.溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州325027）

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國名貴的藥用真菌，其子實體素有“仙草”之稱，具有很高的保健和藥用價值，衛(wèi)生部已批準靈芝為食品新資源。靈芝在中國、日本、韓國等國家的應用已有2000 多年的歷史，目前在加拿大、美國等西方國家也廣受歡迎，據(jù)估計，全球靈芝產品的市場超過15 億美金[1]。靈芝含有多種化學成分，如多糖、靈芝酸、甾醇、核苷、生物堿、蛋白質、脂肪酸等，其中多糖被認為是靈芝的主要活性成分之一，靈芝多糖的研究一直受到國內外學者的廣泛關注，目前從靈芝中分離獲得的靈芝多糖超過200種[2]。靈芝多糖具有調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗輻射、抗疲勞等多種生物活性[3-9]。

目前，靈芝的生產主要有固體培養(yǎng)法和深層發(fā)酵法。固體培養(yǎng)方法經(jīng)濟有效，可以長出子實體，且取材方便，是一種有效的獲取靈芝產品的方法；但固體培養(yǎng)法的缺點是培養(yǎng)周期較長，且較難有效地確定培養(yǎng)終點和嚴格控制產物的含量和質量。深層發(fā)酵方法不受季節(jié)的影響，且液體菌種的培養(yǎng)周期短，成本低，能快速增殖菌體細胞，活性物質的有效成分易于控制，能顯著提高生產效率等優(yōu)點，受到人們的廣泛關注[5，10-13]。研究表明，液體深層發(fā)酵生產的靈芝多糖與來源于靈芝子實體、孢子的靈芝多糖具有相似的功效[13-14]，液體深層發(fā)酵技術是獲取靈芝多糖類化合物的重要手段[5，7，12-15]。

1 培養(yǎng)基

1.1 碳源

靈芝深層發(fā)酵中可利用的碳源包括葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、酒糟等。但不同的菌株對各種碳源的利用率不同，而且同一菌株生產不同的代謝產物時亦可能需要不同的最佳碳源，如有研究表明乳糖作為碳源利于產胞外多糖，而葡萄糖有利于產胞內多糖[16]。

葡萄糖等單糖是靈芝菌的優(yōu)質碳源，但葡萄糖質量濃度太高和太低都不利于胞外多糖產率的提高，太低時營養(yǎng)基質用于長菌體的比例增加但葡萄糖質量濃度大于60 g/L 時，延滯期要滯后24 h 左右，產量反而下降，說明較高質量濃度碳源對菌體生長具有抑制作用[17]；葡萄糖的濃度一般應控制在5%以內，羅建成等的研究表明在一定范圍內，菌絲體產量和胞外多糖濃度隨葡萄糖含量增大而增大，當葡萄糖含量為5%時產量最高，隨著葡萄糖含量繼續(xù)增加，由于高濃度的葡萄糖對菌絲體的生長產生了抑制效應，產量反而下降[18]；Fang 等的研究亦得到同樣的結論，50 g/L 的起始葡萄糖濃度最有利于胞內、胞外多糖的生產[15]。

蔗糖、乳糖等也是靈芝菌的理想碳源[19-20]；Tang 等的研究表明乳糖是最適于靈芝菌體的生長和胞內多糖的合成，而蔗糖是靈芝胞外多糖合成的最佳碳源[20]。

復合碳源具有原料來源豐富、成本低廉的優(yōu)點，研究表明玉米粉有利于菌絲體的生長和胞外糖肽的生產[21]。靈芝菌可分泌淀粉酶，能利用淀粉為原料進行生長代謝，而且在靈芝液體發(fā)酵時，靈芝菌絲體往往形成菌球，玉米淀粉等的存在還能為菌絲體提供附著物，從而有利于菌體的生長。在發(fā)酵時大多使用葡萄糖與淀粉類物質共同作為碳源，葡萄糖與玉米粉配合作為碳源，多糖產量較高，原因可能是玉米粉中含有維生素、纖維素、核苷酸等多種營養(yǎng)成分，有利于菌絲體的生長和多糖的積累與分泌[22]。

1.2 氮源

相對于無機氮源，靈芝對有機氮源利用更迅速，采用有機氮源有利于提高細胞生長速率和最終生物量，并可促進代謝產物的生產。一般靈芝適用的有機氮源有酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅粉、麩皮等。研究表明蛋白胨有利于多糖的生產[16]；豆粕粉最適合靈芝菌絲生長，尿素最適合靈芝胞外糖肽生產[21]；對于靈芝深層發(fā)酵，有時采用配合氮源更有利于菌體的生長代謝，方慶華等的研究表明同時添加5 g/L 蛋白胨和10 g/L酵母膏條件下細胞生長達到最大（15.8 g/L），胞內多糖產量也達到最大（0.858 g/L），但胞外多糖產量在同時添加5 g/L 蛋白胨和5 g/L 酵母膏條件下達到最大，達0.805 g/L[23]。常景玲等研究后認為以蛋白胨與麩皮配合氮源，靈芝多糖產量最高[22]。胡煥榮認為氮源是靈芝菌絲體主要物質，氮源過少會導致菌絲體生命力較弱，出現(xiàn)菌絲體提前自溶，在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中除玉米粉、豆粕粉中帶入的氮源外，再采用酵母膏補充氮源，有利于靈芝菌絲體的生長及多糖的生產[24]。

由于研究菌株的不同，也有研究認為無機氮源亦可促進靈芝代謝產物的生產，梁海秋研究了靈芝2165的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，硝酸銨為氮源時胞外多糖的產量最高，達3.422 g/L，胰蛋白胨和硫酸銨次之，大豆粉也不錯，尿素和大豆蛋白胨較差[25]。

使用復合碳、氮源由于有原料來源豐富、成本低廉的優(yōu)點，是工業(yè)化生產的首選，劉高強等采用中心組合旋轉設計法和響應曲面法獲得多糖發(fā)酵的最優(yōu)配方為：玉米粉19.6 g/L，麩皮粉11.0 g/L，豆餅粉6.7 g/L，蔗糖19.1 g/L，150 L 發(fā)酵罐中試放大結果表明，多糖產量為1.86 g/L[26]。

1.3 無機鹽

靈芝菌絲體生長需要礦質元素，如鐵、鎂、磷、鉀、鈉、銅、錳、鉬、鉻等。研究表明K+、Mg2+和Fe2+可以促進靈芝多糖液態(tài)發(fā)酵，在種子液培養(yǎng)基基礎上加入0.2%Fe2+更有利于靈芝多糖產量的提高[27]。

Hsieh 等的研究結果顯示缺乏磷酸鹽可顯著降低菌絲體中多糖含量，而限制鎂離子供應則能得到大分子量的低產量多糖[28]。陳志杰等采用Plackett-Burman試驗設計，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿干粉、蛋白胨、黃豆芽汁、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、ZnSO4·7H2O、VB1、谷氨酸鈉等對靈芝生長及產胞外多糖相關因子進行試驗，結果表明蔗糖、KH2PO4和MgSO4對靈芝菌絲生長及靈芝產胞外多糖具有顯著影響[29]。

一般在靈芝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)時，往往使用自來水及玉米淀粉、酵母膏等復雜營養(yǎng)成分，在這些營養(yǎng)成分中含有靈芝生長代謝所需的大部分無機鹽，一般情況下，只要在培養(yǎng)基中加入磷酸二氫鉀（0.1%～0.2%），硫酸鎂（0.05%～0.15%）就能達到靈芝菌絲體的生長要求[24]。

1.4 生長因子及促進劑

玉米粉、酒糟、糖密等復雜營養(yǎng)基質有利于靈芝菌的生長及其代謝產物的生產，其中原因之一就是這些營養(yǎng)基質中含有維生素等生長因子。目前研究的靈芝發(fā)酵生長因子及促進劑主要包括維生素、植物油、醇類物質等。研究表明在一定濃度范圍內，VB1能促進菌絲體生長和提高多糖產量，肖雷等認為以添加10 mg/L濃度的效果最佳[17]；而胡煥榮認為在培養(yǎng)基中加入VB150 mg/L 能促使菌絲體生長粗狀[24]。張華山等的研究認為在培養(yǎng)基中添加VB5作為生長因子能更好地促進多糖的合成，效果優(yōu)于VB1[16]。

在一定含量范圍內，三十烷醇能促進菌絲體生長并提高多糖產量，其中以添加1 mg/L 三十烷醇的效果最佳，這可能是由于三十烷醇在一定含量范圍內能改善細胞的通透性所致[18]。其它小分子醇類也有類似的作用，Yang 等的研究表明在培養(yǎng)基中添加1.5%的乙醇或丙醇亦可促進靈芝菌絲體的生長及其胞外多糖的生產[30]。

在靈芝菌的工業(yè)發(fā)酵過程中，由于菌體、蛋白等成分的存在會產生泡沫，往往需在培養(yǎng)基中添加一定量的植物油，研究表明在培養(yǎng)基中加入1%的豆油、花生油、紅花子油、玉米油、葵花子油、橄欖油可不同程度地促進靈芝菌的生長，除豆油外，其它植物油均可促進胞外多糖的合成[10]；Chang 等的研究亦表明紅花子油（3.44 g/L）能顯著促進菌體生長，橄欖油（3.96 g/L）可提高多糖的合成[19]。Yang 等還研究了脂肪酸對靈芝菌發(fā)酵的影響，表明在0.3 g/100 mL 添加量內，棕櫚酸、油酸可促進菌體的生長及胞外多糖的合成，硬脂酸在低添加量（0.1 g/100 mL）亦可促進菌體的生長及胞外多糖的合成，而亞油酸對靈芝菌的生長代謝有抑制作用[10]。

一些中藥成分對靈芝菌的深層發(fā)酵具有顯著影響，并能促進靈芝菌活性產物的生物合成。黨參、枸杞、山藥、薏苡仁、蘆薈等中藥的水提物（187.5 g 生藥/L 水提液）可促進靈芝菌的生長；薏苡仁、黨參、山藥、牛膝的醇提物可促進靈芝菌的生長及胞外多糖的生產[31]；Liu 等的研究表明藥用昆蟲蜣螂在添加量為5 g/L 時能顯著促進靈芝胞內多糖和胞外多糖的形成（P＜0.05），胞內多糖和胞外多糖的產量分別由對照的（1.93±0.09）g/L 和（520.3±20.2）mg/L 提高到（2.41±0.12）g/L 和（608.9±20.2）mg/L，但添加蜣螂發(fā)酵后，靈芝胞內多糖和胞外多糖主要組分的合成途徑并未改變[32]。

2 培養(yǎng)條件

2.1 接種量與菌齡

菌齡太小，接種后的延滯時間變長，發(fā)速時間拉長，菌齡太老，菌絲容易老化自溶，都不利于靈芝菌的生長及代謝產物的生產，一般靈芝菌的菌齡以4 d～5 d比較適合[18]。

接種量的大小決定了菌體的生長速度。靈芝深層發(fā)酵一般的接種量以5%為宜[17-18]；李平凡等的結果顯示8%～10%最佳[33]；胡煥榮認為在發(fā)酵罐發(fā)酵時接種量在10%可大大提高了設備的利用率，降低了發(fā)酵周期，減少了雜菌污染機會[24]；不同的發(fā)酵產物生產時可能需要不同的接種量，方慶華等的研究認為表明低的接種量有著較高的平均生長速度，但是其多糖產量較低；在接種量為170 mg/L 條件下胞內和胞外多糖的產量分別為0.699 g/L 和0.670 g/L，而高的接種量有利于多糖的秤，在接種量為670 mg/L 條件下胞內和胞外多糖的產量卻分別達到1.220 g/L 和0.874 g/L[23]。

2.2 pH

靈芝菌可在較寬的pH 范圍（3～7.5）生長[11]，但以微酸性（pH 為5.5～6.5）為最佳，當pH 低于3.5，菌絲體生長緩慢，甚至停止生長并產生自溶現(xiàn)象[24]。但不同菌株的最適pH 差異非常大，如紫芝胞外多糖發(fā)酵在初始條件設為pH 5.4 時產生最多，而赤芝、甜芝胞外多糖的發(fā)酵產量不受初始pH 試驗范圍的影響；赤芝、紫芝在初始pH 4.8 條件下發(fā)酵胞內多糖積累最少，而甜芝此條件下發(fā)酵胞內多糖積累最多[34]。

菌絲體的生長和胞外多糖生產的最適pH 并不一致。Babitskaya 等的研究表明pH 6～7 最適宜菌體生長，pH 6～4 有利于胞內及胞外多糖的合成[11]，Chang 等獲得了類似的研究結果，菌體生長最適pH6.5，多糖為5.5～6.5[19]；李平作等研究了靈芝發(fā)酵過程中pH 的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)起始pH 為5.5 有利于菌體生長及多糖的合成，pH 控制在5.5 時生物量最大，但多糖產量最低；若在發(fā)酵過程中控制pH 在4.0 時，胞外多糖產量最高，較未控制提高24%[35]；然而，Yang 等認為pH 4～4.5 最有利胞外多糖的合成，控制pH 恒定在4 不利于多糖的合成[36]；Fang 等的研究表明pH 6.5 時最有利于靈芝菌體生長，將pH 從6.5 降至3.5 有利于胞內及胞外多糖的生產[37]。毛健等采用分階段的pH 控制策略，初始pH 6.0，菌體生長前期（0 h～40 h）控制pH 為5.5，40 h～48 h 控制pH 5.0，48 h 后至發(fā)酵結束控制pH4.5，靈芝胞外多糖最高達到3.23 g/L[38]。

2.3 溫度

靈芝發(fā)酵的生長溫度范圍較廣，靈芝菌在22 ℃～35 ℃內都可以生長。但生長的最佳溫度范圍要窄一些，而且不同的菌株亦不一樣，胡煥榮認為溫度是菌絲體中酶反應的必須條件，在高溫條件下酶反應快，菌絲體生長也快，但菌絲體容易衰老，不易積蓄多糖。在低溫條件下，各種酶反應不協(xié)調，菌絲體也就停止生長，靈芝菌最佳生長溫度為（27±1）℃[24]；肖雷等的研究表明靈芝菌在25 ℃～30 ℃生長勢良好，28 ℃是生長的最適溫度[11，17-18]。稍高的溫度有利于靈芝代謝產物的生產，Yang FC 等認為30 ℃～35 ℃適宜靈芝菌生長及胞外多糖的合成[36]；Chang MY 等認為最適菌體生長與多糖合成的溫度為34 ℃[19]。

2.4 通風與攪拌

靈芝多糖的發(fā)酵在實驗室常在搖瓶中完成，而工業(yè)生產則在不同規(guī)格的發(fā)酵罐中完成。菌絲體深層發(fā)酵過程中氧氣過多過少都會影響菌絲體生長，而培養(yǎng)基中溶解氧與通風量、罐壓、攪拌的轉速有關，通風量過大，易導致菌絲體衰老，并增加雜菌帶入的機會；罐壓過高，二氧化碳的含量增加，抑制靈芝菌絲體生長；攪拌的轉速過快，導致菌絲體纖維組織損壞，培養(yǎng)基的稠密度增加，影響氧氣在培養(yǎng)基中的溶解度。胡煥榮確認發(fā)酵罐操作條件為通風量在1：0.3 m3/m3·h～0.5 m3/m3·h，罐壓0.5 kg/cm2，轉速90 r/min 左右，靈芝菌絲體生長條件最佳[24]。孫金旭等在7 L 發(fā)酵罐中得出靈芝真菌培養(yǎng)的最佳工藝為轉速200 r/min、通氣量200 L/h，在此條件下菌絲體最大產量達7.35 g/L，胞外多糖干重最高產量達0.92 g/L[39]。

靈芝菌是好氧真菌，對培養(yǎng)基中的溶氧進行調節(jié)，控制溶在較高水平有利于菌體生長及多糖的合成，發(fā)酵控制在最適溶氧80%水平時，生物量、胞內多糖、胞外多糖可比不控制條件下分別提高46%、44%和21%[38]。

3 展望

現(xiàn)階段國內外對靈芝液體深層發(fā)酵技術的已取得較大進展，在發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和發(fā)酵過程的優(yōu)化等方面作了大量研究，研發(fā)了二階段pH 控制[39]、補料-分批發(fā)酵[12]、補料與三階段光照相結合[40]等發(fā)酵工藝，篩選了植物油、脂肪酸、醇類、表面活性劑、中藥提取物等外源促進劑以提高靈芝多糖的生物合成[10，19，30-32]。但目前對靈芝發(fā)酵促進劑的研究還只停留在種類篩選、添加濃度及對活性成分生物合成促進效果的分析，而對其促進機理的研究尚在起步階段。另外，有關高等真菌多糖生物合成代謝途徑及其調控方面的研究基本是一片空白，靈芝多糖的研究也主要集中在靈芝多糖的分離、結構鑒定、藥理作用，以及培養(yǎng)技術方面，國內外尚未見靈芝菌多糖合成代謝途徑及其調控方面的研究。靈芝子實體和菌絲體產生的多糖在結構、活性上不盡相同，發(fā)酵促進劑提高靈芝多糖發(fā)酵生產機理以及靈芝多糖合成過程的解析應是靈芝多糖發(fā)酵研究的重要內容，加強這些方面的研究，實現(xiàn)靈芝多糖生物合成的定向調控，可促進高活性靈芝多糖組份的發(fā)酵生產。

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