劉書臣，廖明濤，林森森，趙巧靈，戴志遠，2，*（.浙江工商大學水產品加工研究所，浙江杭州30035；2.浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江杭州30035）

金槍魚組胺檢測技術研究進展

劉書臣1，廖明濤1，林森森1，趙巧靈1，戴志遠1，2，*（1.浙江工商大學水產品加工研究所，浙江杭州310035；2.浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江杭州310035）

組胺是一種有潛在危害的含氮低分子量有機化合物，廣泛存在于各種食品中，在以金槍魚為代表的紅肉魚中容易大量產生。攝入過量的組胺會對人體產生危害，組胺已經成為判斷金槍魚質量的標準之一。對近年來金槍魚肉中組胺的檢測技術進行了綜述，包括分光光度法、反相高效液相色譜法、離子色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、電化學法和比色法等，并對檢測技術的研究前景進行了展望。

金槍魚；組胺；檢測技術

金槍魚類是硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Pereiformes），鯖科（Scombridae）魚類中具有胸甲的魚類的總稱，廣泛分布于太平洋、大西洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域[1]。常見的金槍魚類有5個屬，17個種。金槍魚屬的7種金槍魚即長鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、北部藍鰭金槍魚、南部藍鰭金槍魚、大西洋金槍魚、青甘金槍魚，它們和鰹屬的鰹魚被稱為主要金槍魚類，這8種金槍魚占全世界金槍魚漁獲量的70%以上[2]。金槍魚肉質柔嫩鮮美，蛋白質含量高，氨基酸配比優(yōu)越，富含DHA、EPA等具有生物活性的高度不飽和脂肪酸，是世界營養(yǎng)學會推薦的三大營養(yǎng)魚之一，有“海底雞”的美譽。

金槍魚作為主要的紅肉魚種，其體內含有較多的游離組氨酸，當魚捕撈后，若不能進行迅速、正確的處理，在產組胺菌的作用下，魚肉中的組氨酸經過脫羧作用會產生大量的組胺[3-4]。食用已經腐敗或者被微生物污染的金槍魚會引起組胺中毒，組胺攝入量達8 mg～40 mg即可引起輕微中毒[5]。組胺中毒的特點是發(fā)痛快、癥狀輕、恢復快、潛伏期短，表現(xiàn)為精神萎頓、過敏、皮膚潮紅、嘔吐、腹瀉等[6]。美國FDA要求進口的水產品中組胺不超過50 mg/kg；歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺不得超過100 mg/kg；我國規(guī)定鮐魚中組胺不得超過1 000 mg/kg，其它魚類小于300 mg/kg。組胺已經成為檢驗金槍魚安全與否的重要指標，因此金槍魚肉中組胺含量的檢測就顯得尤為重要。本文綜述了近些年國內外金槍魚肉中組胺的檢測技術研究現(xiàn)狀，并對其研究前景進行了展望。

1 分光光度法

分光光度法是我國國標《水產品衛(wèi)生標準的分析方法》（GB/T 5009.45-2003）規(guī)定的水產品中組胺測定方法。它的原理是利用三氯乙酸對魚肉進行浸泡，再用正戊醇提取魚肉中的組胺，組胺與偶氮試劑發(fā)生反應會顯橙色，然后利用分光光度計于480 nm處測其吸光度，并與標準系列比較進行定量分析。

朱文慧等[7]在國標的基礎上對分光光度法測定金槍魚罐頭中組胺的方法進行了改進，包括三氯乙酸浸提、正戊醇的提取方式、鹽酸提取液濃度等。結果顯示在60℃水浴、30 min條件下，三氯乙酸的提取效果最佳；正戊醇提取過程采用旋渦后離心的方式代替了分液漏斗振搖，獲得了較佳的提取效果；鹽酸提取液改為1.0 mL，實驗結果的準確性高。該方法的測定結果相對標準偏差均小于5%，組胺平均回收率在81.54%以上。黃志勇[8]采用0.2%對氨基苯磺酸-0.4%HCl-10%NaNO2-2.0%Na2CO3顯色體系，測得魚肉中組胺濃度在2.8 μg/mL內吸收呈線性，測定的回收率在80%以上，變異系數(shù)小于4.5%。此方法直接與安全的氨基苯磺酸重氮化反應，避免了有致癌性的對硝基苯胺的使用，去掉了有毒的有機溶劑。

分光光度法測組胺具有不需要貴重儀器、操作簡單、成本低等優(yōu)點。但是此方法樣品處理時間長，僅三氯乙酸浸泡就要3 h；偶氮試劑對硝基苯胺具有致癌性，長期接觸對人體有害；結果重現(xiàn)率不高，不適宜用于組胺的快速檢測。

2 色譜法

2.1 反相高效液相色譜

反相高效液相色譜（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）是目前應用最廣泛的組胺檢測技術之一。RP-HPLC的固定相采用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠和辛烷基硅烷鍵合硅膠等非極性物質，典型的流動相是甲醇和乙腈。在RPHPLC中，組分根據(jù)其極性大小實現(xiàn)分離，極性大的先流出色譜柱，極性小的后流出[9-10]。利用RP-HPLC可以分離幾乎所有的有機化合物，因此RP-HPLC被多數(shù)研究者選擇用來進行金槍魚肉中組胺的定量分析。由于組胺在可見和紫外可見區(qū)域沒有較明顯的吸收，也不含熒光成分，因此在檢測前需要對組胺進行衍生處理，衍生劑主要是丹磺酰氯和苯甲酰氯鄰苯二甲醛等。Saeed等[11]比較用苯甲酰氯鄰苯二甲醛進行柱前衍生和柱后衍生對金槍魚肉中組胺檢測結果的影響，發(fā)現(xiàn)柱前衍生能顯著增強檢測的靈敏度，而且衍生產物穩(wěn)定，檢測結果更加準確。

檢測器是RP-HPLC檢測組胺的重要組成部分，可分為紫外檢測器（UV）、熒光檢測器（FLD）和二極管陣列檢測器（DAD），其中UV檢測器是目前應用最多的檢測器。邢麗紅等[12]利用UV檢測器檢測水產品中的組胺含量，組胺濃度在0.5 g/mL～20.0 g/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)r>0.999，檢出限為25 mg/kg。Saeed等[11]同時用FLD和UV檢測器檢測金槍魚肉中的組胺含量，發(fā)現(xiàn)FLD的檢測效果遠比UV檢測的效果好，UV檢測的結果有55%偏差較大，而FLD檢測的結果重復性好，組胺在5.0 g/mL～100.0 g/mL范圍內有較好的線性關系，最低檢出限1.5 mg/kg[11]。二極管陣列檢測器是一種新型的檢測器，Cinquina A.L.[13]利用DAD對金槍魚樣品進行檢測，組胺的檢測結果線性關系良好，r>0.999，最低檢出限為0.5 mg/kg，組胺平均回收率在92%以上。

反相高效液相色譜具有分析速度快、檢測靈敏度高、定量分析準確、柱效高等優(yōu)點，是目前金槍魚肉中組胺檢測的主要手段。但是由于組胺在紫外可見區(qū)域沒有較明顯的吸收，利用反相高效液相色譜檢測前需要對組胺進行衍生處理，檢測時間較長，成本較高。

2.2 離子色譜

離子色譜法（Ion Chromatograph，IC）是以離子交換劑為固定相的分析離子的一種液相色譜方法，主要利用離子之間對離子交換樹脂親和力的差異而實現(xiàn)物質分離。離子色譜又分為高效離子交換色譜（HPIC）、離子排斥色譜（IEC）和離子對色譜（IPC），用于3種分離方式的柱填料的樹脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但樹脂的離子交換功能基和容量各不相同。離子色譜的檢測限為每升微克至每升毫克級，常用的檢測器有電化學檢測器和光學檢測器，常常在流動相中加入一定量的有機溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動相中的溶解度[10]。

李立等[14]采用反相分配離子對色譜法對魚肉中的組胺進行測定，通過對儀器條件的選擇以及新的提取凈化方法的建立，使組胺的檢出限達到0.05 mg/kg，線性回歸系數(shù)為0.999 7。Cinquina A.L.等[15]以中等強度和低疏水性的弱離子交換聚合色譜相為分離柱填料，采用電導檢測器對金槍魚肉中的組胺進行了檢測，該方法簡化了原料的處理過程，檢測分析過程簡單、快速，結果重現(xiàn)性好；同時通過比較發(fā)現(xiàn)，電導檢測器法在樣品處理和峰形上均優(yōu)于脈沖安培檢測法和全脈沖安培檢測法。

離子色譜主要用于陰、陽離子的分析，可同時測定多種離子，具有簡便、快速的優(yōu)點。組胺是較弱的陽離子，適于采用離子色譜法進行測定。與其它組胺檢測方法相比，離子色譜不需要衍生過程，縮短了分析時間，減少了衍生化帶來的干擾和衍生物不穩(wěn)定等問題，提高了分析方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[9]；離子色譜的檢測限為每升微克至每升毫克級，可以精確測量低濃度的組胺。但是離子色譜柱貴，易受污染，檢測成本高，難以廣泛推廣。

2.3 薄層色譜

薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC），又稱薄層層析色譜，是一種固液吸附色譜。具體方法是將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，待點樣、展開后，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定。TLC是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼具柱色譜和紙色譜的優(yōu)點。TLC不僅可以用來進行少量樣品的分離，同時也可以通過加厚吸附層來分離大量樣品，特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度下易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質[10]。TLC已經被廣泛的應用于魚肉中組胺的檢測。

Shakila R.J.等[16]比較了TLC法和HPLC法測定魚肉中的生物胺，發(fā)現(xiàn)TLC法測定生物胺的結果線性關系和重現(xiàn)性均比HPLC差，但是能較好的實現(xiàn)不同生物胺的分離，可以準確的對組胺進行定量分析，而且測定時間短、價格低廉，適用于組胺的快速測定。Chin K.D.H等[17]利用層析色譜法同時對組胺、酪胺、色胺和苯乙胺進行分離檢測，以丹磺酰氯為衍生劑，四種生物胺檢測結果均具有良好的重現(xiàn)性和線性關系。Lapa-Guimaraes和Pickova[18]用一種半定量薄層色譜，同時分離檢測了魚肉中包括組胺在內的多種生物胺，其中組胺的檢測結果在1.0 μg/mL～50 μg/mL內呈線性，最低檢出限為10 ng。

與其它的組胺分離檢測方法相比，TLC不需要昂貴的儀器、操作簡單快捷，能有效降低檢測成本，可用于組胺的定性和半定量分析。但是需要花費大量時間進行結果的處理與分析，樣品檢測前也需要進行衍生處理。

3 毛細管電泳

毛細管電泳（Capillary Electrophoretic，CE），是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的新型液相分離技術。目前在毛細管電泳分離生物胺的技術中，僅有毛細管區(qū)帶電泳技術可直接對生物胺進行分析測定而不需要衍生化過程。

張麗瑤等[19]提出了毛細管電泳-2，3-萘二甲醛（NDA）柱前衍生高靈敏安培檢測組胺的新方法，通過對衍生反應條件和電泳分析條件，包括衍生試劑濃度、衍生溶液的pH、衍生反應時間、分離介質的pH、進樣時間和分離電壓進行了優(yōu)化，使組胺測定靈敏度提高了6倍，為測定痕量組胺提供了一個新方法。Lange J.等[20]比較了CE法和HPLC法對鮭魚、鯡魚、鱈魚等多種食品中生物胺的測定結果，研究發(fā)現(xiàn)毛細管區(qū)帶電泳可以大大縮短樣品前處理和分離時間，CE法9 min內可以實現(xiàn)各種生物胺的分離，而HPLC需要20 min。Kvasnicka和Voldrich[21]提出了一種高效快捷的CE法，不需要對樣品進行衍生，只需要稀釋、酸性萃取和過濾等步驟，能夠實現(xiàn)對奶酪、啤酒、牛奶等食品中生物胺的檢測。該方法在10 min內分離了包括組胺在內的六種生物胺，其中組胺檢測結果在5μmol/L～100μmol/L內呈線性，r=0.999 8，可以應用于魚肉中組胺的檢測。

帶有紫外檢測器的毛細管電泳法目前是比較流行的組胺檢測方法。它與傳統(tǒng)的電泳技術和現(xiàn)代色譜技術相比，具有較高的靈敏性和重現(xiàn)性、分離速度快、儀器簡單、無污染等優(yōu)點，但是和HPLC一樣，由于組胺在紫外檢測區(qū)域沒有較強的吸收峰，因此不能直接進行檢測，也需要先對樣品進行衍生處理。

4 電化學法

電化學法（Electrochemical method）是近幾年來發(fā)展起來的一種新的檢測組胺的方法，此方法的應用需要同時建立能快速檢測被分析物在電化學作用下所引起變化的檢測系統(tǒng)。

Behrouz等[22]建立了一種高效流動電化學法對金槍魚樣品進行組胺檢測的方法，條件為pH 2.0，電位掃描頻率40 V/s，蓄積電勢900 mV，蓄積時間0.4 s，同時還建立了一種精確分析被檢測物信號變化和減少雜音影響的基于數(shù)字化方法的電腦檢測系統(tǒng)。檢測結果在1.1 pg/mL～5 555 pg/mL范圍內線性良好，r=0.998，最低檢出限為0.35 pg/mL。Draiscir等[23]研制了一種測定組胺的電化學生物傳感器，通過檢測樣品在電化學作用下產生的過氧化氫量來對組胺進行檢測。傳感器主要是由一個鉑電極和一個固定的銀/氯化銀電極構成，其中二胺氧化酶經固定后與鉑電極的端部緊密接觸。采用該方法對魚肉中的組胺進行檢測，檢測結果良好，證實了電化學生物傳感器能夠有效測定魚肉中產生的組胺。

與其它方法相比，電化學法具有精確、省時等優(yōu)點，同時能夠克服魚肉中成分復雜和組胺含量低等困難，能夠實現(xiàn)組胺的低濃度準確檢測。但是電化學法測組胺還需要同時建立相應的檢測系統(tǒng)，生物傳感器所采用的生命活性物質容易受到環(huán)境中各種有害氣體和微生物的污染，壽命過短。因此，采用電化學法測定金槍魚肉中的組胺還有待于更深一步的研究。

5 比色法

S.B.Patange等[24]建立了一種比色定量法對組胺進行快速檢測，該方法是以咪唑環(huán)與β-苯基重氮磺酸鹽的相互作用為基礎的比色定量法。不同濃度的組胺會與顯色劑反應顯現(xiàn)出不同的顏色，顯色過程是在試管中進行的，主要步驟包括均質、離心、震蕩和蒸發(fā)等。首先將不同濃度的組胺標準品進行顯色處理，以確定不同濃度組胺所對應的顏色，然后對樣品進行顯色處理與標準品進行比較，同時檢測樣品和標準品在496nm處的紫外吸收強度，觀察其結果是否具有相關性。結果顯示線性關系良好r>0.995，組胺平均回收率為91%，最低檢出濃度為10 mg/kg。S.B.Patange還將此方法與HPLC法測組胺進行比較，兩者檢測結果非常接近，HPLC的檢測結果略高。

比色定量法法整個檢測過程只需45 min，檢測成本低，通過視覺上的差別判斷來進行組胺的定量分析，適宜于管理機構在沒有實驗室條件的情況下對魚肉中的組胺進行實時監(jiān)控。但是該方法的最低檢出濃度較高、結果重現(xiàn)率不高、精確度低，受人為因素影響較大。

6 展望

金槍魚及其制品中組胺的檢測備受關注除了因為其潛在的毒性，同時也是由于組胺可以作為一個重要指標來判斷金槍魚的腐敗程度。組胺的檢測有兩個比較大的困難，首先是魚肉中生物胺種類多，成分復雜，需要將組胺與其它生物胺進行分離；第二是組胺濃度較低時難以準確檢測[25]。目前測定金槍魚組胺的技術方法有分光光度法、反相高效液相色譜法、離子色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、電化學法和比色法等，其靈敏度、精密度、特異性各異，實用性也不同。

近年來，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）也被用來進行組胺的檢測[26]，但是尚未應用于金槍魚肉中組胺的檢測。目前美國和澳大利亞市場上在售的ELISA試劑盒有ALERT試劑盒和VERATOX試劑盒，其中ALERT的組胺有效檢測范圍為5 mg/L～50 mg/L，檢測時間為2 h，VERATOX的檢測范圍為0～50 mg/L，檢測時間為1 h。這些ELISA試劑盒檢測結果均具有較好的重復性和準確性，但是由于價格不菲而難以應用于日常大量樣品的定性與定量分析，廣泛推廣受阻。因此需要開發(fā)一種靈敏度高、耗時短、成本低、實用性強的檢測方法；同時，前處理方法的優(yōu)化和不同檢測方法的聯(lián)合應用也將是今后金槍魚組胺檢測的重點研究方向。隨著科學技術的發(fā)展和檢測設備的不斷改進，相信一定能夠研發(fā)出更加適用于金槍魚肉中組胺檢測的方法，實現(xiàn)金槍魚肉中組胺的快速定性與定量分析，進而幫助管理機構和生產廠商加強對金槍魚質量的監(jiān)管與控制。

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Review on Detecting Techniques of Histamine of Tuna

LIU Shu-chen1，LIAO Ming-tao1，LIN Sen-sen1，ZHAO Qiao-ling1，DAI Zhi-yuan1，2，*
（1.Research Institute of Aqutic Products Processing，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，Zhejiang，China；2 State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，Zhejiang，China）

Histamine is an nitrogenous organic compound with low molecular weight.Generally，it has potential hazard to human health，and always existed in food，especially in some red meat fish like tuna.Ingesting excessive histamine could cause toxicity to human，and histamine has been one of the standards to judge the meat quality of tuna.The detecting techniques of histamine of tuna were reviewed in this paper，including spectrophotometry，reversed phase high performance liquid chromatography，ion chromatograph，thin layer chromatography，capillary electrophoretic，electrochemical method and colorimetric method，and the prospect of the future developmentwas made.

tuna；histamine；detecting techniques

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.033

2013-07-26

國家海洋863計劃（2012AA0922302）；國家科技支撐計劃（2012BAD28B05）；浙江省科技廳重大項目（2012C03009-3）；浙江省科技廳重點項目（2012C12008-3）

劉書臣（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：水產品加工與貯藏。

*通信作者：戴志遠，研究員，博士生導師。