徐艷冰，王乃志，楊麗麗，崔華東，薛紅霞，張　寧

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第二風濕免疫科，沈陽 110001)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。膠原誘導關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠與RA病理機制類似，加之對自身免疫的敏感性，是常用的實驗模型[1]。

肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PADI4)是一種翻譯后修飾酶，可將精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基。PADI4在RA患者血清中含量明顯升高，在機體內(nèi)產(chǎn)生自身抗PADI4抗體，并且PADI4瓜氨酸化多種蛋白質(zhì)引起機體自身的免疫反應參與RA的發(fā)生與發(fā)展[2-5]。本研究擬在CIA大鼠模型上應用PADI4特異性抗體，觀察其與CIA的相關(guān)性，探討PADI4在CIA不同時期發(fā)病中的作用，以為臨床診斷RA提供新的理論依據(jù)，并為RA治療提供方向。

材料和方法

實驗動物及分組

2012年7月至2013年5月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗中心將清潔級雌性Wistar大鼠[(體重為(100±20) g]30只(盛京醫(yī)院實驗中心動物部提供)適應性飼養(yǎng)1周后隨機選取6只為對照組，其余24只均建立CIA模型，其中6只模型建立失敗，其余關(guān)節(jié)炎模型建立成功且關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)>2分的18只大鼠隨機分為CIA3周模型組、CIA4周模型組及CIA6周模型組，每組6只。分別予以生理鹽水1 ml/d(對照組)、0.5 mg/ml雞Il型膠原(CIA模型組)皮內(nèi)注射，并于免疫后3，4，6周按組別處死。比較各組大鼠體重、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足趾容積及PADI4表達的變化情況。參考對照組評價PADI4與關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性。

主要藥品及試劑

雞Ⅱ型膠原(CCⅡ)及完全弗氏佐劑(CFA)為Sigma公司產(chǎn)品，PADI4抗體購自NOVUS公司。

CIA模型建立

將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的CCⅡ與等體積的CFA充分乳化，配成終濃度為0.5 g/L的乳劑。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后，模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液，總量為1 ml。1周后上述方法、相同劑量再進行1次。對照組注射等體積的生理鹽水。

取材與包埋

實驗結(jié)束時處死大鼠，取左后足跖趾關(guān)節(jié)，10%多聚甲醛固定1周，脫鈣液(鹽酸加甲酸溶液)脫鈣，用大頭針檢測脫鈣滿意后，將關(guān)節(jié)常規(guī)脫水、包埋、切片；同時分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，立即放入液氮中，隨后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

抗PADI4抗體測定

采集CIA模型鼠及正常對照組鼠靜脈血2 ml，離心后血清分裝，并于-80℃低溫冰箱保存待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗PADI4抗體試劑盒購自美國R&D公司，具體步驟按照說明書進行。每板均設陰性對照、陽性對照。以正常對照組抗PADI4抗體濃度的第95百分位數(shù)的可信區(qū)間最大值定陽性閾值。

免疫組織化學染色

跖趾關(guān)節(jié)標本均用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，采用SP染色，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，組織抗原熱修復。滴加一抗(1∶150的兔抗PADI4)后4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，室溫孵育20 min。各步驟間以PBS沖洗5 min，連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復染。光鏡下觀察，胞膜或胞漿著棕黃或棕色者為陽性表達。計算染色后PADI4表達陽性細胞的數(shù)目。每個處理組做3張染片，每張染片隨機計數(shù)10個非重疊視野(×400)下的陽性細胞數(shù)。圖片采集設備為NIS-Elements F3.0，分析軟件為Nikon NIS-Elements BR3.0。

蛋白質(zhì)印跡Western blot檢測

采用不同時期CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜進行。取保存于-80℃中的膝關(guān)節(jié)滑膜，加入適量裂解液裂解滑膜組織，超聲破碎儀破碎組織后取上清，采用BCA Protein Assay Kit測蛋白濃度后，每個樣品均調(diào)整為40 μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣20 μl后進行SDS-PAGE電泳。電壓強度為80 V，電泳1 h后，改為120 V，電泳2 h。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)移的條件設定為恒電壓100 V，2 h。然后將PVDF膜浸泡入5%的脫脂牛奶中2 h，加入一抗后4℃孵育過夜(1∶1 000的兔抗PADI4，1∶15000鼠抗GAPDH)。復溫30 min，TBST洗膜后加入二抗(1∶5 000的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG)室溫下孵育2 h，TBST洗膜后進行ECL顯色反應、曝光、顯影、過水、定影。

觀察指標

一般情況觀察：大鼠體毛色澤、活動狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測定大鼠體重。

AI：根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹、顏色及關(guān)節(jié)活動情況記錄并評價大鼠全身關(guān)節(jié)病變程度，每7天評定1次，共評定6次。評分標準：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)稍腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹。四肢肢體的病變程度累積積分為AI，最高為16分。

足趾容積測定：根據(jù)排水法原理，用自制的關(guān)節(jié)容積測量器測量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積，每周測量1次，共測6次。

統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一般情況

致敏后約第14天大鼠足部及踝關(guān)節(jié)皮膚開始發(fā)紅，輕度腫脹，關(guān)節(jié)炎開始形成。約第28天左右，關(guān)節(jié)腫脹達高峰，體重增長緩慢(表1)。左側(cè)足趾容積變化見表2。

血清抗PADI4抗體水平及陽性率比較

CIA組血清中抗PADI4抗體陽性率為44.4%(8/18)，高于對照組16.67%(1/6)，兩組陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

免疫組織化學染色

PADI4在骨組織和滑膜中的分布基本相同。陽性表達主要位于軟骨周邊單核細胞、侵潤細胞胞漿及骨髓腔中，陽性細胞數(shù)明顯多于對照組，且染色亦深于對照組(圖1)。

CIA組初次免疫3、4、6周后骨組織中PADI4蛋白陽性細胞染色光密度值分別為(0.2898±0.0120)、(0.2982±0.0220)、(0.2974±0.0310)，明顯高于對照組(0.2530±0.0127)，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。初次免疫后第3周，部分細胞內(nèi)可見少量PADI4陽性表達；第4周時PADI4表達明顯增多，隨著病情的進展，其表達有所減少。

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果

初次免疫后第3周，可見PADI4陽性表達條帶；第4周PADI4蛋白表達條帶強度最深，隨后其表達水平降低；實驗結(jié)束時，即第6周仍有陽性表達(圖2)。

討　　論

表1各組大鼠實驗不同階段體重變化

分組0d7d14d21d28d42d對照組111 00±5 10155 50±3 11183 25±6 13197 50±6 36251 00±5 19257 01±3 89膠原誘導關(guān)節(jié)炎模型組112 17±11 16152 33±12 39169 00±13 80190 00±22 63207 00±33 94247 50±42 97

表2各組大鼠實驗不同階段左側(cè)足趾容積變化

分組0d7d14d21d28d42d對照組1 263±0 0761 335±0 1011 447±0 1011 522±0 1561 630±0 1371 707±0 124膠原誘導關(guān)節(jié)炎模型組1 255±0 1301 355±0 0831 472±0 1041 963±0 1342 421±0 1202 290±0 121

RA以關(guān)節(jié)滑膜炎性反應為特征，疾病多呈漸進型發(fā)展。早診斷、積極治療是預防控制RA病情發(fā)展的前提，但是鑒別診斷RA和其他自限性疾病比較困難，確診RA往往要在數(shù)月甚至數(shù)年之后，易造成不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)畸形和強直，致殘率較高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體(anticyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)是目前特異性相對最好的早期診斷指標之一，能在出現(xiàn)臨床癥狀之前就出現(xiàn)并可被檢測到，對于早期、非典型、類風濕因子陰性的RA患者有較大的診斷價值，且與RA的嚴重程度相關(guān)。肽酰精氨酸脫亞胺基酶(peptidylarginine deiminase，PADI)是催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的關(guān)鍵性酶，其基因多態(tài)性也因此成為研究RA易感性和發(fā)病機制的熱點[6-8]。在RA患者體內(nèi)，PADI蛋白本身也可以成為自身抗體的目標[9-11]，并且可能在原位形成免疫復合物促進了炎性反應[12]。RA患者血清中存在特異性抗PADI4抗體，陽性率為50%，與病情程度相關(guān)[9-10]。國內(nèi)研究顯示，抗PADI4抗體對RA診斷的敏感性為45%，特異性為93.5%，RA患者血清中抗PAID4抗體的陽性率是45%，抗PADI4抗體與病情活動指病活動性評分和抗CCP抗體具有相關(guān)性[13]。Shi等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)，50%類風濕因子陰性RA患者中抗PADI4抗體陽性，43%抗角蛋白抗體陰性患者中抗PADI4抗體呈陽性，60% CCP陰性患者中抗PADI4抗體陽性。以上結(jié)果表明抗PADI4抗體是RA特異性較高的抗體，尤其在類風濕因子、抗角蛋白抗體和抗CCP抗體陰性RA患者中有較高診斷價值。有研究顯示RA患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗PADI4抗體以IgG1和IgG3兩個亞群為主[15]，主要識別PADI4的4個線性肽段，即N端序列P22(211～230)、P28(271～290)，C端序列P61(601～620)、P63(621～640)，自身抗體可能是通過阻止PADI4與鈣離子和底物的結(jié)合從而抑制PADI4介導的纖維蛋白原瓜氨酸化過程[16]。然而RA患者自身如何產(chǎn)生抗PADI4抗體的機理尚未明了，一種可能是機體在對瓜氨酸蛋白產(chǎn)生免疫反應之后通過表位擴展進而產(chǎn)生了抗PADI4抗體；另一種可能是某種基因亞型的患者體內(nèi)PADI4表達增加，進而打破免疫耐受產(chǎn)生抗體[13]?？筆ADI4抗體是否參與或如何參與RA發(fā)展過程并未闡明?？梢钥隙ǖ氖牵琍ADI4與RA的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，可能是RA的致病抗原之一。PADI4或抗PADI4抗體可以成為新的臨床輔助檢測標志物，但是對于PADI4如何打破免疫耐受仍然未知。

CIA是于1977年發(fā)現(xiàn)，因其臨床表現(xiàn)、關(guān)節(jié)病理、細胞及體液免疫等方面與人類RA接近，被廣泛用于RA發(fā)病機制及藥物評價等方面的研究，是目前比較理想的RA模型[17]。本實驗設想若鼠關(guān)節(jié)炎模型與人RA中PADI4的表達情況相似，從而可更方便、簡潔、有效的進行活體實驗。對PADI4研究的深入不僅有助于理解翻譯后修飾在生命過程中的重要意義，還可以對未來藥物的開發(fā)提供新的方向。而且PADI4與RA相關(guān)性的研究對闡明RA的發(fā)病機制和RA的診斷有著十分重要的意義，有可能為RA的治療開辟新途徑。

本研究顯示，在CIA發(fā)病的早期即初次免疫后第3周，PADI4即處于陽性表達狀態(tài)，早于臨床癥狀即關(guān)節(jié)腫脹之前出現(xiàn)，隨后PADI4表達逐步升高，到初次免疫后第4周達到高峰，后略有降低，但直到6周實驗結(jié)束時，PADI4仍處于較高水平的陽性表達狀態(tài)。從上述實驗結(jié)果可以看出，在CIA發(fā)病過程中，PADI4在疾病發(fā)展過程中處于早期陽性狀態(tài)。通過本研究結(jié)果可以推測，抑制PADI4基因表達有望用于RA的治療，但蛋白的復制翻譯轉(zhuǎn)錄是一個復雜的過程，各途徑之間存在各種交互聯(lián)系，相互協(xié)同、相互制約共同介導RA病理過程，因此，還需要大量的動物實驗及臨床試驗來進一步研究。因此，抑制PADI4基因表達能否用于RA的治療，還需要大量的動物及臨床實驗來證實。

(本文圖1、2見插頁Ⅰ)

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