錢 方，張守峰，王述超，劉 曄，趙敬慧，米立娟，張 菲，王 穎，扈榮良

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染導(dǎo)致的人獸共患傳染病，在世界范圍內(nèi)均有流行。至今狂犬病無有效的治療手段，一旦發(fā)病死亡率幾乎為100%。目前，廣泛使用的狂犬病滅活苗均為注射劑[1]，對流浪犬及野生動物并不適用。狂犬病口服疫苗已在部分發(fā)達(dá)國家野生動物狂犬病防控中起到重要作用[2]，其中以犬2型腺病毒(Canine adenoviruses type 2，CAV-2)為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的重組活疫苗因其自身優(yōu)點(diǎn)，得到越來越多的研究應(yīng)用[1,3-5]。

CAV-2是腺病毒的典型成員，能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因[6]，感染呼吸道及消化道，誘發(fā)粘膜免疫，免疫原性強(qiáng)[7]。此外，CAV-2不能在人體內(nèi)復(fù)制，生產(chǎn)及使用的安全系數(shù)極高。本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的以CAV-2弱毒疫苗株為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組病毒(CAV-2-RV-CGS)經(jīng)口服可使犬產(chǎn)生長達(dá)兩年的有效保護(hù)，并經(jīng)過系統(tǒng)試驗(yàn)，獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《轉(zhuǎn)基因生物安全證書》[6]。

與其他腺病毒類似，犬腺病毒(Canine Adenovirus, CAV)對犬有較高的自然感染率，且疫苗接種等人為因素也會令犬體內(nèi)存在CAV中和抗體，過高的中和抗體水平會干擾重組病毒的感染和復(fù)制，影響其免疫效果[8]。Akerstedt J于2010年報道斯堪的納維亞半島和斯瓦爾巴特群島60%以上的野生犬科動物呈CAV中和抗體陽性[9]。N. Wright于2013年對南非兩個省份的部分犬只CAV-2中和抗體進(jìn)行調(diào)查，分別有45%和62%的犬只存在自然CAV-2感染，且95%的陽性犬只中和抗體≥64[10]，進(jìn)一步評估體內(nèi)CAV-2抗體對口服疫苗的影響，試驗(yàn)犬通過疫苗接種感染CAV-2，盡管其中和抗體水平低于自然感染，經(jīng)單次口服免疫CAV-2-RVG，沒有獲得針對狂犬病的特異性抗體，結(jié)果表明表達(dá)RABV-G的CAV-2重組口服疫苗在南非地區(qū)不能有效預(yù)防犬科動物狂犬病[10]。

為明確我國家養(yǎng)犬體內(nèi)CAV中和抗體背景，為重組疫苗施用提供數(shù)據(jù)支持，特選取我國部分狂犬病流行和非流行地區(qū)為研究對象，以病毒中和試驗(yàn)對來自河北省、北京市、吉林省等地區(qū)城鄉(xiāng)犬只血清樣本的CAV中和抗體進(jìn)行定量檢測和分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1犬血清及分組 于河北省農(nóng)村，北京市各區(qū)寵物醫(yī)院，吉林省農(nóng)村等地隨機(jī)采取犬血清387份，其中河北省147份，北京市195份，吉林省45份。

1.2病毒及細(xì)胞 能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的重組犬2型腺病毒(CAV-2-EGFP)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。犬腎細(xì)胞系(MDCK)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3犬腺病毒中和抗體測定試驗(yàn)

1.3.1血清滅活及稀釋 將待測血清在56 ℃水浴條件下滅活30 min，對每個樣品進(jìn)行編號。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL含有3%胎牛血清的DMEM，在每個培養(yǎng)板第一列分別加入不同的待測樣品50 μL/孔，用50 μL多道移液器對血清樣品進(jìn)行3倍連續(xù)稀釋至3-9，即所產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)為1/3，1/9，1/27，1/81，1/243，1/729，1/6561，1/19 683，棄掉最后一列孔中吸出的50 μL液體。

1.3.2抗體的中和 血清稀釋完畢后，從-20 ℃冰柜中取出CAV-2-EGFP使其融化，用含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將滴度為106.875TCID50/100 μL病毒稀釋成100 TCID50/100 μL，100 μL每孔加入已有血清樣品的細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃感作60 min(最多不超過90 min)。

1.3.3加入細(xì)胞 感作結(jié)束前10 min，消化MDCK細(xì)胞，加入適量DMEM，使細(xì)胞濃度達(dá)到5×104個/ml，每孔中加入50 μL細(xì)胞懸液，整個操作過程中槍頭不應(yīng)接觸液面及孔壁。

1.3.4培養(yǎng) 將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2濕溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.5檢測 于熒光顯微鏡下讀取結(jié)果，以孔內(nèi)完全沒有熒光的血清稀釋度作為最終中和效價，并將低于1∶27的最終中和效價視為陰性，即體內(nèi)CAV中和抗體對表達(dá)RABV-G的CAV-2重組口服疫苗效果無影響。

1.3.6血清毒性對照：將3-1稀釋的血清樣品每孔100 μL加入微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃感作60 min后，每孔加入50 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×104個/mL。

1.3.7空白對照 每孔加入250 μL細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到5×104個/mL，且不加病毒及待測血清。

1.3.8陰性和陽性血清對照 與待檢血清進(jìn)行平行試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

血清毒性對照顯示，加入血清后，細(xì)胞長勢良好，對試驗(yàn)結(jié)果無干擾。CAV-2-EGFP與梯度稀釋的血清樣品作用后，感染MDCK細(xì)胞48 h，在熒光顯微鏡下觀察，顯示無綠色熒光的證明病毒被該中和抗體完全中和，顯示綠色熒光的證明病毒沒有或者未完全被血清中的CAV中和抗體中和，該方法可直觀有效的判定樣品中CAV的中和抗體。CAV-2-EGFP被完全中和的臨界條件是病毒能夠被稀釋后的樣品抗體剛好完全中和，可以用以下公式表示N=3-k×A×p (N為病毒量，A為樣品抗體含量，p為抗原抗體反應(yīng)系數(shù)，3-*k為樣品稀釋度)。中和試驗(yàn)可以確定各血清樣品熒光陰性的最大稀釋度，見表1。

表1 血清最大稀釋梯度下熒光陰性的樣品數(shù)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室研究經(jīng)驗(yàn)，判定熒光陰性最大稀釋度低于或等于3-3的樣品為CAV中和抗體陰性，最大稀釋度高于3-3的樣品為CAV中和抗體陽性。其中，腺病毒中和抗體陽性率河北省犬只為18%，吉林省為7%，北京市為69%；腺病毒中和抗體陰性率河北省犬只為82%，吉林省為93%，北京市為31%。農(nóng)村犬與城市犬CAV中和抗體有明顯差異，農(nóng)村犬只中腺病毒中和抗體陽性率為16%，陰性率為84%，城市犬中腺病毒中和抗體陽性率為69%，陰性率為31% 。

3 討 論

近年來我國各地區(qū)頻發(fā)惡犬傷人事件，犬只仍是主要傳染源。目前已從鼬獾[11]，蝙蝠[12]等野生動物中分離出狂犬病毒，且今年臺灣地區(qū)爆發(fā)跨種屬的狂犬病疫情，引人關(guān)注。發(fā)達(dá)國家對犬的免疫率達(dá)到70%，即可有效控制狂犬病的擴(kuò)散與傳播[13]，但是很多原因使該目標(biāo)在發(fā)展中國家難以實(shí)現(xiàn)[10]。其中包括：RV弱毒活疫苗接種動物后，可在體內(nèi)繁殖，有毒力返祖的危險；傳統(tǒng)的濃縮滅活苗需要多次免疫增加抗原接種量，以獲得較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致成本增加，且免疫程序繁瑣[3]；流浪犬及野生動物無法通過非口服免疫途徑進(jìn)行有效免疫。因此針對犬的口服免疫研究就顯得尤為重要。

過去幾十年中，口服疫苗在控制野生動物狂犬病中取得了較好的成績。在歐洲，使用弱毒SAD株口服疫苗大量免疫狐貍，從而控制RABV向非疫區(qū)的擴(kuò)散[14]，但是SAD株有引起嚙齒類動物和家養(yǎng)動物發(fā)生狂犬病的危險。表達(dá)RVBV-G的重組痘病毒載體疫苗雖然對動物安全，但某些人群接觸該疫苗免疫的動物可能引發(fā)強(qiáng)烈的皮膚炎癥反應(yīng)及一系列痘病毒感染癥狀[15]。

以CAV-2作為載體的口服狂犬疫苗避免了以上缺陷，但一些研究認(rèn)為動物自然感染CAV引起過高的中和抗體會阻礙免疫[8]，甚至導(dǎo)致無法有效免疫犬科動物[10]。本試驗(yàn)對我國部分地區(qū)城鄉(xiāng)犬只CAV中和抗體進(jìn)行調(diào)查，其中農(nóng)村自然感染CAV犬所占比例較低，僅為16%。而城市犬只多作為寵物犬，需要進(jìn)行包括犬腺病毒在內(nèi)的疫苗接種，因此城市犬體內(nèi)普遍存在較高的CAV中和抗體(陽性率為69%)。由于已有試驗(yàn)證明，有效控制狂犬病在種群中的擴(kuò)散需使種群免疫率達(dá)到70%以上[13]，因此對于存在眾多流浪犬及家養(yǎng)犬的我國北方廣大農(nóng)村地區(qū)，因犬自然感染腺病毒率低，可以大量投放經(jīng)濟(jì)有效的表達(dá)RABV-G的CAV-2重組口服疫苗，而城市犬則主要通過非口服免疫突進(jìn)預(yù)防狂犬病，從而降低整個地區(qū)狂犬病感染率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhou M, Zhang GQ, Ren GP. Recombinant rabies viruses expressing GM-CSF or flagellin are effective caccines for both intramuscular and oral immunizations[J]. PLoS ONE, 8(5): e63384. DOI: 10.1371/journal.pone.0063384

[2]Christine FG, Robert R, Dennis D, et al. Comparing onrab and raboral V-RG oral rabies vaccine filed performance in raccoons and Striped Skunks, New Brunswick, Canada, Maine, USA[J]. J Wildl Dis, 2012, 48(1): 157-167. DOI: 10.7589/0090-3558-48.1.157

[3]Esh JB, Cunningham JG, Wiktor TJ. Vaccine-induced rabies in four cats[J]. J Am Vet Med Assoc, 1982, 180: 1336-1339.

[4]Hu RL, Zhang SF, Fooks AR, et al. Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein[J]. Microbes Infect, 2006, 8: 1090-1097. DOI: 10. 1016/j.micinf.2005.11.007

[5]Li JW, Faber M, Papaneri A. A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice[J]. Virology, 2006, 356: 147-154. DOI: 10.1016/j.virol.2006.07.037

[6]Zhang S, Liu Y, Fooks AR, et al. Oral vaccination of dogs (Canisfamiliaris) with baits containing the recombinant rabies-canine adenovirus type-2 vaccine confers long-lasting immunity against rabies[J]. Vaccine, 2008, 26: 345-350. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.11.029

[7]Qin JL. Study on PPR recombinant vaccine based on canine adenovirus type 2 and adeno-associated virus type 1 vector[D]. Changchun: Jilin University, 2013. (in Chinese)

秦俊嶺. 基于犬2型腺病毒和1型腺相關(guān)病毒載體的小反芻獸疫重組疫苗的研究[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2013.

[8]Bru T, Salinas S, Kremer EJ. An update on canine adenovirus type 2 and its vector[J]. Viruses, 2010, 2: 2134-2153. DOI: 10.3390/v2092134

[9]Akerstedt J, Lillehaug A, Larsen I, et al. Serosurvey for canine distemper virus, canine adenovirus,Leptospirainterrogans andToxoplasmagondii in free-ranging canids in Scandinavia and Svalbard[J]. J Wildl Dis, 2010, 46(2): 474-480. DOI: 10.7589/0090-3558-46.2.474

[10]Wright N, Jackson FR, Niezgoda M, et al. High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines[J]. Vaccine, 2013, 31: 4177-4182. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.06.089

[11]Zhang SF, Zhao JH, Liu Y, et al. Characterization of a rabies virus isolate from a ferret badger (Melogalemoschata) with unique molecular differences in glycoprotein antigenic site III[J]. Virus Res, 2010, 149: 143-151. DOI: 10.1016/j.virusres.2010.01.010

[12]Liu Y, Zhang SF, Zhao JH. Isolation of Irkut virus from aMurinaleucogasterbat in China[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(3): e2097. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002097

[13]Belotto A, Leanes LF, Schneider MC. Overview of rabies in the Americas[J]. Virus Res, 2005, 111: 5-12. DOI: 10.1016/j.virusres.2005.03.006

[14]Schneider LG, Cox JH, Muller WW, et al. Current oral rabies vaccination in Europe: an interim balance[J]. Rev Infect Dis, 1988, 10(Suppl 4): S654-659.

[15]Mempel M, Isa G, Klugbauer N, et al. Laboratory acquired infection with recombinant vaccinia virus containing an immunomodulating construct[J]. J Invest Dermatol, 2003, 120: 356-358. DOI: 10.1046/j.1523-1747.2003.12074.x