房師松，柴燕文，王 昕，呂 星，吳春利，程小雯，張仁利，薛 紅，程錦泉

2.香港科技大學(xué)生命科學(xué)部應(yīng)用基因組中心，香港 999077

隨著達(dá)菲大量應(yīng)用于臨床，流感病毒在NA和HA上的耐藥性突變株及耐藥性突變位點(diǎn)逐漸增多［1］，特別是H275Y是近年來季節(jié)性H1N1流感病毒對達(dá)菲產(chǎn)生耐藥性的主要分子機(jī)制［2－3］，流感病毒已在藥物選擇的壓力下出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，并呈擴(kuò)散趨勢［4－5］。自2009年6月WHO報(bào)道了第1例耐奧司他韋的甲型H1N1流感病例，截止到2010年5月已累計(jì)報(bào)道了290例對奧司他韋耐藥的甲型H1N1流感病例，我國大陸也發(fā)現(xiàn)1例對達(dá)菲耐藥的病例［6－7］。雖然耐藥的甲型H1N1流感病毒目前只占很小的比例，但是英國和以色列已經(jīng)報(bào)道了耐奧司他韋的甲型H1N1流感病毒在人與人之間能相互傳播［8－9］。因此，目前的研究除了要準(zhǔn)確檢測甲型H1N1流感病毒之外，還應(yīng)準(zhǔn)確檢測流感病毒的耐藥位點(diǎn)是否發(fā)生突變，從而判斷流感病毒是否已對達(dá)菲類藥物產(chǎn)生耐藥性。

本研究主要應(yīng)用了新型的SNP基因分型技術(shù)：單熒光標(biāo)記延伸的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測方法——OLE（One－label extension）［10］，再結(jié)合熒光偏振技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對耐藥性位點(diǎn)基因型的快速分型，從而建立一種具有臨床應(yīng)用前景的高通量、高敏感性及特異性、操作簡便、判讀結(jié)果直觀明確、檢測費(fèi)用低，能快速、準(zhǔn)確檢測流感病毒耐藥位點(diǎn)突變的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 隨機(jī)選取深圳市2009－2010年流感監(jiān)測的甲型H1N1流感病例標(biāo)本，細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)分離的流感病毒毒株為研究材料，共包括51株新甲型H1N1流感病毒，所有病毒都經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)型別和亞型。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒購自瑞士Roche公司，One Step RNA PCR Kit（AMV）購自Takara公司，膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司，OLETMSNP Detection Kit Y－C/T 購自香港華晶基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從GenBank隨機(jī)下載30條甲型H1N1的NA基因序列，通過MEGA分析，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。F1：5′－GCTGTCCTATTGGTGAAGTTCC－3′；R1：5′－CAGGAGCATTCCTCATAGTAATAATTAGGGGCATTCAT－3′；F2：5′－ATGAATGCCCCTAATTATTACTATGAGGAATGCTC－3′；R2： 5′－CCGCTATATCCTGACCACTCAT－3′；OLE引物（Sense）：5′－CGAAATGAATGCCCCTAATTAT－3′，OLE 引 物 （Anti－sense）：5′－AACAGGAGCATTCCTCATAGT－3′。1.2.2 病毒RNA的提取 病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞或9～11日齡雞胚分離培養(yǎng)，使用 High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，操作方法詳見試劑盒說明書。

1.2.3 NA基因待測樣本、陽性和陰性對照樣本的制備 由于甲型H1N1流感病毒H275Y位點(diǎn)發(fā)生突變的陽性樣本難以獲得，為了在檢測時(shí)有陽性和陰性對照，利用重疊延伸PCR法進(jìn)行定點(diǎn)突變的克隆。

1.2.3.1 RT－PCR 擴(kuò) 增 按 Ta KaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）操作說明進(jìn)行，50份待測樣本用引物F1、R2進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，NA基因突變位點(diǎn)陽性和陰性對照的克隆用引物組合（F1、R1）、（F2、R2）和（F1，R2）進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物于1%濃度瓊脂糖凝膠中電泳，分析產(chǎn)物。

1.2.3.2 NA基因陽性、陰性對照的克隆與鑒定參照QIAGEN Gel Extraction Kit說明書回收引物組合（F1、R1）、（F2、R2）和（F1，R2）的擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%濃度瓊脂糖凝膠中電泳，分析回收的產(chǎn)物。引物（F1，R2）的RT－PCR回收產(chǎn)物為定點(diǎn)突變陰性對照。重疊延伸擴(kuò)增（定點(diǎn)突變陽性對照）的反應(yīng)體系為：10×EX Taq buffer 2.5μL，d NTP Mixture（各10 mmol/L）2μL，EX Taq 0.5μL，回收產(chǎn)物（F1、R1）1.5μL，回收產(chǎn)物 （F2、R2）1.5μL，F(xiàn)1（20 μmol/L）0.5μL ，R2（20μmol/L）0.5μL，RNase free H2O 16μL。反應(yīng)條件：94℃2 min，（94℃30 s，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min）循環(huán)5次，72 ℃ 10 min；加引物F1和 R2；94℃2 min，（94℃30 s，50℃50 s，72℃1 min）循環(huán)25次，72℃10 min。于1%濃度瓊脂糖凝膠中電泳，分析重疊延伸擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收上述的PCR產(chǎn)物。

上述回收的陽性和陰性對照產(chǎn)物分別與PGEM－T載體在T4 DNA連接酶作用下16℃連接1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑單個(gè)菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和基因測序鑒定，篩選出陽性克隆子（PGEM－T－T）和陰性克隆子（PGEM－T－C）。

1.2.4 產(chǎn)物的純化 利用OLETMSNP Detection Kit Y－C/T里的試劑純化50份待測甲型H1N1流感病毒樣本、PGEM－T－T和PGEM－T－C的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)體系為：5μL PCR產(chǎn)物，PCR clean－up Reagent 0.4μL，PCR clean－up Buffer 4.6μL，反應(yīng)條件為：37℃45 min，85℃15 min。1.2.5 檢測反應(yīng)體系 采用OLETMSNP Detection kit Y－C/T試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系為：10×Reaction buffer 2μL，OLE polymerase 0.3μL，Extension MixⅠ＆ Ⅱ 各1.5μL，OLE引物（5μmol/L）1μL，純化產(chǎn)物2.5μL，RNase free H2O 12.7μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min，（95℃30 s，55℃30 s）循環(huán)30次，16℃保溫。待測反應(yīng)物避光放置于熒光偏振儀上進(jìn)行檢測。

1.2.5.1 純化產(chǎn)物濃度的優(yōu)化 在純化產(chǎn)物中加入RNase free H2O，獲得的濃度分別為800、400、200、100、50、25（ng/μL），同時(shí)進(jìn)行 OLE反應(yīng)，在熒光偏振儀上檢測。

1.2.5.2 OLE sense和 Anti－sense引物信號對比

其他反應(yīng)體系不變，分別加入OLE sense引物與OLE Anti－sense引物，同時(shí)進(jìn)行OLE反應(yīng)，在熒光偏振儀上進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 用引物F1、R2擴(kuò)增50份樣本，經(jīng)1%凝膠電泳確認(rèn)，均獲得733 bp的目的片段。

2.2 重疊延伸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 引物組合（F1、R1）、（F2、R2）和重疊延伸擴(kuò)增產(chǎn)物（F1，R2）進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%凝膠電泳確認(rèn)，產(chǎn)物的大小分別為364 bp、407 bp和733 bp，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3對引物擴(kuò)增NA基因M：100 bp DNA Marker；1：F1、R2擴(kuò)增產(chǎn)物；2：F1、R1擴(kuò)增產(chǎn)物；3：F2、R2擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of three pairs of primers of NA geneM：100 bp DNA marker；1：PCR amplification with F1 and R2；2：PCR amplification with F1 and R1；3：PCR amplification with F2 and R2.

2.3 克隆子的測序結(jié)果 陽性克隆子（PGEM－TT）和陰性克隆子（PGEM－T－C）在第275位氨基酸突變位點(diǎn)的測序結(jié)果分別是T和C。

2.4 OLE反應(yīng)中RT－PCR純化產(chǎn)物濃度的優(yōu)化分別做野生型（C）和突變型（T）的濃度優(yōu)化，梯度為800、400、200、100、50、25（ng/μL），從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，野生型（C）和突變型（T）的最佳濃度均為200 ng/μL。

2.5 OLE sense和 OLE anti－sense信號對比 分別做OLE sense和OLE anti－sense引物信號的對比，檢測陰性對照和3份樣本，結(jié)果如圖2和3。從圖中可知，OLE sense的信號明顯強(qiáng)于OLE antisense的信號。

圖2 利用OLE sense引物檢測樣本的FP值1：陰性對照；2～4：分別是3份待測樣本Fig.2 FP value of sample with OLE sense primer1：Negative control；2－4：Three samples.

圖3 利用OLE anti－sense引物檢測樣本的FP值1：陰性對照；2～4：分別是3份待測樣本Fig.3 FP value of sample with OLE anti－sense primer1：Negative control；2－4：Three samples.

2.6 OLE－FP法檢測50份樣本的結(jié)果：待測的50份甲型H1N1流感病毒樣本經(jīng)RT－PCR、純化后，利用OLE法檢測第275位耐藥位點(diǎn)發(fā)生突變的情況。從圖4中可知，全部待測樣本均是C，未發(fā)生T突變，說明未對達(dá)菲出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。

50份樣本的測序結(jié)果：為了驗(yàn)證OLE－FP法的準(zhǔn)確性，同時(shí)對50份樣本進(jìn)行測序。

結(jié)果如圖5所示。從圖中可知，50份樣本在第275位點(diǎn)的測序結(jié)果均是C，未發(fā)生T突變，這與OLE－FP法的檢測結(jié)果一致。

3 討 論

神經(jīng)氨酸酶抑制劑是流感病毒神經(jīng)氨酸酶競爭性可逆抑制劑，在低濃度下能抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，可作用于NA蛋白酶活性中心，能有效地阻斷流感病毒的感染、復(fù)制和傳播。研究表明NA基因的某氨基酸殘基的突變可以使病毒對這類抗流感毒藥物產(chǎn)生耐藥性，包括E119V、R292K、R293K、N294S和H275Y，這些位點(diǎn)都直接或間接參與了神經(jīng)氨酸酶的催化，一旦有氨基酸發(fā)生替換均會影響神經(jīng)氨酸酶的活性，會對神經(jīng)氨酸酶抑制劑產(chǎn)生耐藥，特別是H275Y是近年來季節(jié)性H1N1病毒產(chǎn)生對達(dá)菲產(chǎn)生耐藥性的主要分子機(jī)制［2－3］。

圖4 OLE法檢測50份樣本的FP結(jié)果Fig.4 FP result of 50 samples with OLE method

圖5 50份樣本的正向測序結(jié)果TA－T：PGEM－T－T，陽性對照；TA－C：PGEM－T－C，陰性對照；OLE引物：OLE正向引物；01F～50F：50份樣本編號正向測序Fig.5 Forward sequence result of 50 samplesTA－T：PGEM－T－T，positive control；TA－C：PGEM－T－C，negative control；OLE primer：OLE forward primer；01F－50F：Result of forward sequence of 50 samples.

目前，報(bào)道的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測方法非常多，但這些方法都存在一些問題。有些方法成本低，但速度慢，通量低，不適合自動(dòng)化分析；有些方法可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，自動(dòng)化分析，但設(shè)備與耗材的高昂價(jià)格，制備探針成本高，準(zhǔn)確性低，并不適合像我國這樣的發(fā)展中國家的需要。一個(gè)理想的檢測SNP的方法必須具備以下優(yōu)點(diǎn)：（1）適合自動(dòng)化操作、簡便、迅速；（2）分析費(fèi)用低，特殊試劑用量少；（3）反應(yīng)要嚴(yán)緊，樣品純度不高也可得到可靠的結(jié)果；（4）數(shù)據(jù)分析簡單，易于自動(dòng)化分析；（5）反應(yīng)的通量要大而靈活［11］。到現(xiàn)在為止還沒有一個(gè)符合以上條件的理想方法出現(xiàn)，因此，有必要通過進(jìn)一步的優(yōu)化和完善以往的檢測方法，建立一種新型的SNP檢測方法。

本研究中SNP兩態(tài)性的檢測在兩個(gè)延伸反應(yīng)中進(jìn)行，每一個(gè)延伸反應(yīng)檢測其中一種等位基因。根據(jù)突變位點(diǎn)及其之后的第一個(gè)堿基的類型選擇是以單堿基（single－base extension，SBE）還是雙堿基（two－base extension，TBE）延伸模式進(jìn)行反應(yīng)，以滲入的熒光標(biāo)記脫氧核苷三磷酸（R110－d NTP）產(chǎn)生的熒光偏振值（或稱為熒光極化量）作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，然后再結(jié)合熒光偏振檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對耐藥性位點(diǎn)基因型的快速分型。

為了提高OLE－FP法檢測結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性，應(yīng)用重疊延伸PCR法對第275位氨基酸的堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變的克隆，分別克隆陽性對照和陰性對照。此外，為了使該分型技術(shù)更能適用于甲型H1N1流感病毒耐藥位點(diǎn)的檢測，我們對RT－PCR產(chǎn)物純化的濃度和OLE引物進(jìn)行了優(yōu)化，確定出最佳的OLE反應(yīng)體系。同時(shí)，為了驗(yàn)證本方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們采用傳統(tǒng)的Sanger測序法對耐藥性位點(diǎn)的變異類型進(jìn)行了測序，得到的第275位氨基酸里的堿基序列與OLE－FP法的檢測結(jié)果一致，均為C，未出現(xiàn)T突變，提示達(dá)菲等神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物對50份甲型H1N1流感病毒樣本依然有效。

本研究以藥物耐藥位點(diǎn)的單個(gè)堿基突變?yōu)檠芯恐攸c(diǎn)，應(yīng)用OLE－FP法建立快速、特異、實(shí)用的突變位點(diǎn)檢測方法，并將該方法應(yīng)用于甲型H1N1流感病毒耐藥性和突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，可提前預(yù)防和控制新的流感流行特別是大流行的再次發(fā)生，同時(shí)，還能應(yīng)用于指導(dǎo)臨床治療，快速篩選出抗流感病毒的藥物，確定藥物使用最佳劑量及制定出最佳治療時(shí)間。該方法體系的建立，也可為其他耐藥性檢測特別是臨床耐藥性細(xì)菌的快速檢測以及其他SNP相關(guān)疾病的臨床檢測提供技術(shù)手段，具有廣泛的擴(kuò)展性和相當(dāng)高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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