宋 月, 崔 敏, 王超群, 付 彤, 韓立強(qiáng), 魏戰(zhàn)勇, 王亞賓

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.北京漢業(yè)先科科技有限公司，北京 101500；3.漯河出入境檢驗檢疫局，河南 漯河 462000)

腸球菌(Enterococcus)屬于D群鏈球菌，20世紀(jì)末從鏈球菌屬分離出來，正式命名為腸球菌屬[1].腸球菌是動物消化道、生殖道常在菌群.近年來對畜禽危害的報道較多，導(dǎo)致的疾病主要有：羔羊的腦炎[2]，敗血癥[3]，造成死雞胚和弱死雛雞[4]，還可引起仔豬的關(guān)節(jié)炎[5]等疾??；腸球菌引起的食物中毒疾病也時有發(fā)生[6].目前，檢測腸球菌的主要方法是活菌計數(shù)法.傳統(tǒng)的活菌計數(shù)方法需要細(xì)菌的分離鑒定，方法繁瑣費時，一般要48～72 h才能出結(jié)果，并且該方法靈敏度低，極易產(chǎn)生假陽性和假陰性，在實際應(yīng)用過程中有很大的局限性，常常需要增菌培養(yǎng)，無法做到對初始樣品中腸球菌數(shù)目的準(zhǔn)確定量.PCR方法的建立為腸球菌的鑒別檢測提供了新的依據(jù)和方法，已經(jīng)逐步成為細(xì)菌檢測的常用方法[7,8].在此基礎(chǔ)上的熒光定量PCR方法以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點在基因表達(dá)水平分析病原體的定性定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[9,10].用熒光定量PCR方法檢測細(xì)菌，可以大大提高檢測的靈敏度和特異性，擴(kuò)大了樣品的檢測范圍，實現(xiàn)了待檢樣品的定量檢測.本試驗根據(jù)GenBank發(fā)表的腸球菌16s rDNA序列，通過序列分析獲得其高度保守的特異性序列，并根據(jù)該特異性保守序列設(shè)計了1對特異性引物.在此基礎(chǔ)上建立了腸球菌SYBR Green I實時定量熒光PCR 檢測方法，并對方法進(jìn)行了評價分析，建立了腸球菌的快速檢測方法.對河南部分地區(qū)及其周邊地市送檢的病料進(jìn)行檢測分析，進(jìn)一步在實踐中驗證方法的可靠性.從而為獸醫(yī)臨床的診斷和治療提供理論支持.

1 材料與方法

1.1菌種與臨床樣品

所用菌株：腸球菌(Enterococcus，ATCC 29212)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC 27853)、大腸桿菌(Escherichiacoli.，ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris，ATCC 12453)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，ATCC 13124)，枯草芽孢桿菌、鏈球菌、乳酸乳球菌為實驗室保存菌種.臨床樣品來自河南各地市及其周邊地市的養(yǎng)殖場.

1.2主要試劑及儀器

Roche公司Light Cycler 2.0型熒光定量PCR儀，M J Research公司PTC-200 PCR擴(kuò)增儀，SYBR Green I熒光PCR試劑、pMD-18 T 載體等購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)公司，引物由上海生工生物工程公司合成.

1.3引物設(shè)計與合成

參考GenBank公布的腸球菌16S rDNA序列，根據(jù)其保守區(qū)間序列設(shè)計合成特異性引物，上游：5′-CCCTTATTGTTAGTTGCCATC- 3′,下游：5′-ACTCGTTGTATTTCCCATTGT-3′，引物由上海生工生物工程公司合成，擴(kuò)增目的片段長度為144 bp.

1.4細(xì)菌核酸的獲取

將各種細(xì)菌在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜，用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法獲取細(xì)菌基因組DNA，貯存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.5質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

以提取的腸球菌基因組DNA為模板，用實驗室已有的通用引物擴(kuò)增16S基因片段.PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物.將回收的目的產(chǎn)物片段與pMD-18 T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選白色菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送上海生工生物公司測序.將測序正確的陽性質(zhì)粒作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用分光光度儀測定濃度后進(jìn)行10倍系列稀釋，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度進(jìn)行分析，根據(jù)公式計算出每微升質(zhì)粒液體中含有的質(zhì)?？截悢?shù).

1.6熒光定量PCR方法的優(yōu)化

采用SYBR Premix Ex Taq 推薦的反應(yīng)體系，以出現(xiàn)最高熒光值、出現(xiàn)最小的樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)以及在融解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰為指標(biāo)，對退火溫度、循環(huán)條件和循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化.

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中選取5個適宜的稀釋度，以這5個稀釋度的質(zhì)粒液體作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個稀釋度做3個平行試驗.對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.8敏感性、特異性和重復(fù)性的檢測

1.8.1 敏感性試驗 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板的稀釋液作為模板進(jìn)行靈敏度的檢測，以在35個循環(huán)是否起跳作為判斷標(biāo)準(zhǔn).若在35個循環(huán)之前起跳，即判定為陽性，即樣品中可以檢測出腸球菌.

1.8.2 特異性試驗 用建立好的擴(kuò)增方法以提取的綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、鏈球菌、乳酸乳球菌等菌株基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗引物的特異性.

1.8.3 重復(fù)性試驗 使用構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒模板，選取3個稀釋度，分別作為模板在同等條件下進(jìn)行擴(kuò)增，每個稀釋度做3個平行試驗，計算Ct值的變異系數(shù)；同時，將上述所用樣品保存，每7 d檢查1次，連續(xù)檢測14 d，計算不同批次間Ct值的變異系數(shù).

1.9臨床檢測

對來自河南省及其周邊地區(qū)的33份患乳房炎奶牛所產(chǎn)的牛奶和28份疑似綠膿桿菌病的剖檢樣品按照實驗室常規(guī)方法進(jìn)行處理后，分別用新建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)的PCR方法進(jìn)行檢測，比較2種方法的陽性檢出率和符合率，并用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行結(jié)果分析.

2 結(jié)果與分析

2.1熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過5個批次的重復(fù)試驗，證明在25 μL反應(yīng)體系中，擴(kuò)增參數(shù)為94 ℃,5 min；循環(huán)40次：94 ℃， 5 s；59 ℃， 20 s；72 ℃，25 s.這種條件下擴(kuò)增效率最高，且溶解曲線無非特異性峰.動力學(xué)擴(kuò)增曲線如圖1，溶解曲線如圖2.溶解溫度分別為86.06，86.05，86.15，86.05，86.04 ℃，平均值為86.07 ℃，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.045，變異系數(shù)為0.000 53；統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，各個溶解溫度之間變異極小，引物特異性強(qiáng).

圖1 熒光定量PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線

圖2 腸球菌擴(kuò)增溶解曲線

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)測定計算得出重組質(zhì)粒拷貝數(shù)為1.74×1011拷貝·μL-1， 經(jīng)10倍系列稀釋后，選取1.74×107至 1.74×103的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3).縱坐標(biāo)為Ct值，橫坐標(biāo)為拷貝數(shù)的對數(shù)；建立函數(shù)關(guān)系，得到二者的線性關(guān)系，斜率為-3.83，截距為39.03，相關(guān)系數(shù)為0.992.結(jié)果顯示良好的線性關(guān)系.

圖3 腸球菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3敏感性試驗

以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板的稀釋液作為模板進(jìn)行靈敏度的檢測，檢測結(jié)果表明，熒光定量PCR的最低檢測量為17拷貝·μL-1.

2.4特異性試驗

擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖4)，只有綠膿桿菌擴(kuò)增為陽性，其他常見菌株，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、鏈球菌、乳酸乳球菌，以及陰性對照擴(kuò)增結(jié)果均為陰性.由圖4可知，只有大腸桿菌在優(yōu)化條件下可以擴(kuò)增出特異性曲線，其它細(xì)菌無擴(kuò)增曲線，試驗表明該方法具有較好的特異性.

1.陰性對照； 2.鏈球菌；3.金黃色葡萄球菌；4.枯草桿菌；5.變形桿菌；6.綠膿桿菌；7.大腸桿菌；8.腸球菌.

1. negative control； 2.Streptococcus；3.Staphylococcusaureus；4.Bacillussubtilis；5.Proteusmirabilis；6.Pseudomonasaeruginosa；7.Escherichiacoli；8.Enterococcus.

圖4特異性擴(kuò)增曲線

Fig.4SpecificdetectionofReal-timePCR

2.5重復(fù)性試驗

單次重復(fù)性試驗結(jié)果如圖5，多次重復(fù)性試驗結(jié)果如表1和表2.從表1，表2可以看出，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗其變異系數(shù)均小于1%，說明建立的熒光定量PCR具有較好的重復(fù)性.

2.6臨床檢測結(jié)果

對總共61份樣品的檢測結(jié)果如表3.熒光定量法和普通PCR檢測雙陽性病料39份，雙陰性病料14份，熒光定量法檢測出單陽性病料8份.二者的符合率為86.89%，熒光定量的陽性率比普通方法高13.11%.用統(tǒng)計學(xué)的方法進(jìn)行分析，采取配對樣品T檢驗，得到2種方法的P值為0.01，差異顯著，表明所建立的熒光定量檢測方法敏感性明顯高于普通方法.

圖5 重復(fù)性擴(kuò)增曲線

表1同一批次樣品重復(fù)性擴(kuò)增結(jié)果

Table1Resultsofrepeatabilitydetectioninthesamebatch

樣品序號NumberofsamplesCt值Ctvalue123平均值±標(biāo)準(zhǔn)差X±S變異系數(shù)/%CV116．2616．4916．5216．42±0．1400．85220．3120．2220．2020．24±0．0500．25324．0624．0223．9824．02±0．0400．17426．8726．8426．8726．86±0．0170．06

表2 所有批次樣品重復(fù)性擴(kuò)增結(jié)果

表3 臨床檢測結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測需要對細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，耗時費力且極易造成假陰性.隨著PCR技術(shù)的誕生，在一定程度上解決了這一問題.但是普通的PCR在定量研究上仍然不能盡如人意，無法準(zhǔn)確的定量檢測樣品中細(xì)菌的數(shù)目，定量檢測仍是一個難題.熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用有效的解決了這一難題，使得微生物的檢測可以在保證方法便捷、結(jié)果可靠的同時做到定量檢測[11].

16S rDNA是細(xì)菌的高度保守序列，其可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異性；選擇可變區(qū)設(shè)計PCR 特異性引物，則可將標(biāo)本中的細(xì)菌鑒定到屬甚至種的水平，是細(xì)菌鑒別較為理想的靶序列[12].本試驗針對腸球菌16S rDNA的特異性保守序列設(shè)計引物，建立腸球菌的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，從而提高檢測的特異性.在特異性檢驗中，用所建立的方法檢測數(shù)十種常見的菌群，均無特異性擴(kuò)增，說明該方法具有良好的特異性.

試驗過程中，首先構(gòu)建腸球菌16S rDNA特異性片段的重組質(zhì)粒，選取5個不同的稀釋度，以這5個稀釋度作為模板分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得不同的擴(kuò)增曲線.擴(kuò)增結(jié)果顯示，樣品的初始濃度越高，Ct值越小，經(jīng)線性回歸分析表明，起始模板濃度與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性回歸關(guān)系.據(jù)此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct計算樣品的初始濃度.

對所建立的方法進(jìn)行重復(fù)性檢驗，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)小于1%，說明該方法準(zhǔn)確率和重復(fù)性良好；其檢測最低限度為17拷貝·μL-1，說明該方法良好的重復(fù)性和較高的靈敏度，可用于腸球菌的臨床檢測.本試驗建立的熒光定量PCR檢測方法可直接對臨床樣品的DNA進(jìn)行檢測，可以在12個小時內(nèi)完成樣品的采集、DNA提取和熒光定量PCR檢測的全程；與傳統(tǒng)方法相比，避免了細(xì)菌增菌培養(yǎng)和細(xì)菌分離環(huán)節(jié)，減少了工作量，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點.對臨床樣品的檢測是該方法的初步應(yīng)用，其與普通方法的符合率85.45%，陽性檢出率比普通PCR方法高18.87%，該方法的建立對腸球菌的檢測具有重要意義，有利于臨床疾病的診斷和食品中腸球菌數(shù)目的檢測，可為畜產(chǎn)品的安全檢測提供一定的檢驗依據(jù).

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