鐘恩惠，王藝磊，王淑紅

集美大學水產(chǎn)學院，廈門 361021

受體報告基因?qū)嶒灱捌湓诰S甲酸和維甲酸X受體干擾物監(jiān)測中的應用

鐘恩惠，王藝磊，王淑紅*

集美大學水產(chǎn)學院，廈門 361021

受體報告基因?qū)嶒灳哂锌焖佟⒔?jīng)濟、靈敏、方便等諸多優(yōu)勢，在高通量篩選類或抗雌雄激素等通過核受體起作用的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物方面得到了廣泛的應用。環(huán)境中的維甲酸和維甲酸X受體干擾物如有機錫等有著類似的作用機制，研究者也開始采用受體報告基因?qū)嶒灥姆椒▽υ擃愇廴疚镞M行篩選與監(jiān)測。本文綜述了受體報告基因?qū)嶒灥募夹g(shù)方法，包括報告基因和宿主細胞的選擇，并介紹了該方法在人工合成的維甲酸和維甲酸X受體干擾物篩選以及環(huán)境樣品中該類污染監(jiān)測中的應用。綜述總結(jié)了應用受體報告基因?qū)嶒灆z測環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究中的不足并對該方法的未來發(fā)展進行了展望，希望為該方法在環(huán)境監(jiān)測和評估中的應用提供新的思路。

受體報告基因?qū)嶒?；維甲酸受體(RAR)；維甲酸X受體(RXR)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可改變生物或其后代、或(亞)群體內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，進而引起不良健康效應的外源化合物[1]。此類污染物涉及的化合物種類繁多，對生態(tài)健康的影響很大，因此，該類污染物的篩選與監(jiān)測一直以來都是環(huán)境科學領域的重點與難點。受體介導是EDCs干擾生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的主要作用機制。研究表明，EDCs具有類似于內(nèi)源性激素的化學結(jié)構(gòu)，與受體有一定的親和力，可通過與受體結(jié)合而對生物產(chǎn)生類或抗激素的干擾作用。

核受體作為配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子，是很多類固醇激素或小分子物質(zhì)發(fā)揮生理作用的媒介。能夠與該類受體結(jié)合的化合物可采用受體報告基因?qū)嶒?receptor reporter gene assay)的方法進行體外篩選。該方法既能檢測外源性化合物與受體的結(jié)合能力，還能區(qū)分激動劑和拮抗劑。相對于體內(nèi)實驗，體外篩選具有快速、經(jīng)濟、方便等優(yōu)勢，在類或抗雌雄激素EDCs的篩選中發(fā)展迅速并且得到了廣泛的應用。研究者對大量化合物的類或抗雌雄激素效應進行了篩選，也對水體[2-3]、食物添加劑[4]、包裝容器[5]等各種環(huán)境樣品中該類EDCs的存在進行了監(jiān)測。

在對類/抗雌雄激素EDCs研究越來越深入的同時，研究者也將目光擴展到能夠與其他核受體結(jié)合的環(huán)境污染物，如類或抗甲狀腺激素[6-7]和維甲酸及維甲酸X受體干擾物[8-9]。很多動物實驗和體外實驗的證據(jù)顯示，維甲酸和維甲酸X受體信號通路極易受到環(huán)境化合物的影響，其中最典型的案例是有機錫，如三丁基錫(tributyltin, TBT)和三苯基錫(triphenyltin, TPT)對海洋腹足類的影響。海水中極低濃度的有機錫可誘導雌性前鰓亞綱腹足類出現(xiàn)雄性特征(如陰莖和輸精管)，發(fā)生性畸變，嚴重時會導致繁殖失敗，甚至種群消亡[10-11]。新近的研究表明，有機錫可能是通過與腹足類動物的維甲酸X受體(retiniod X receptor, RXR)結(jié)合而誘導性畸變的[12]。同時，有機錫化合物在人類[13]、魚類[14-15]和甲殼類[16]中都能作為配體而激活RXR的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生脂類代謝紊亂[17]、免疫失調(diào)[18]、睪酮代謝紊亂[19]等非常嚴重的生物學效應。環(huán)境維甲酸和維甲酸X受體干擾物作為一種危害嚴重的核受體干擾物尚未引起人們的足夠重視。因此，本文就受體報告基因?qū)嶒灧椒ㄒ约霸摲椒ㄔ诃h(huán)境維甲酸和維甲酸X受體干擾物監(jiān)測中的應用進行綜述和展望，希望為該類化合物的篩選和環(huán)境樣品中該類污染物的監(jiān)測和風險評估提供參考。

1 受體報告基因?qū)嶒?/h2>

1.1 受體報告基因?qū)嶒灥臉?gòu)建方法

受體報告基因?qū)嶒灧椒ǖ募夹g(shù)基礎是核受體介導的信號轉(zhuǎn)導機制。首先需要克隆獲得相應受體的編碼區(qū)或功能結(jié)構(gòu)域的序列，并構(gòu)建該受體的超表達質(zhì)粒。同時需要合成核受體與靶基因調(diào)控區(qū)結(jié)合的反應元件(response element, RE)，采用基因重組技術(shù)將RE序列連接到報告基因的調(diào)控區(qū)，構(gòu)建重組報告基因載體。應用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將含核受體編碼區(qū)的超表達載體以及含核受體反應原件的報告基因載體導入宿主細胞(酵母或哺乳動物細胞)，建立相應的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)。當系統(tǒng)中存在能夠與核受體結(jié)合的配體即外源性化合物時，核受體將被激活，然后與報告基因啟動子區(qū)域的RE結(jié)合后，啟動報告基因的表達。最后，通過檢測報告基因編碼的酶活性或蛋白表達量的變化，間接反映內(nèi)源性靶基因的表達情況。

這種方法不僅能夠檢測化合物與受體的結(jié)合能力，還可以檢測結(jié)合后引起的生物學效應，而且能夠區(qū)分激動劑和拮抗劑，因此成為評價和篩選核受體干擾物的有力工具。受體報告基因?qū)嶒灱夹g(shù)主要涉及報告基因和宿主細胞的選擇。

1.2 報告基因的選擇

報告基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，通常是表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。目前受體報告基因?qū)嶒灣Ｓ玫膱蟾婊蛑饕新让顾匾阴；D(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)和熒光素酶(luciferase, Luc)基因4種。

CAT基因來源于大腸桿菌轉(zhuǎn)位子9，該酶在細菌中可以使氯霉素失效并使細菌對氯霉素產(chǎn)生抗藥性。CAT可催化乙酰CoA的乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素，阻止氯霉素與核糖體結(jié)合而使氯霉素失效[20]，可通過同位素、熒光素和酶聯(lián)免疫吸附測定乙酰基化的氯霉素的量而量化CAT的活性。CAT在哺乳動物細胞無內(nèi)源性表達，且性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較短，適于瞬時表達研究。徐莉春[21]以CAT為報告基因建立的受體報告基因?qū)嶒瀸瘜W物質(zhì)的類/抗雄激素進行篩選，成功篩選了一批雄激素受體的激動劑和抑制劑。雖然CAT具有在真核細胞本底低、分析時信噪比較高和重復性好的優(yōu)勢[22]，但由于該檢測方法比較繁瑣，與其他報告基因相比線性范圍較窄且靈敏性較低，因此其應用受到一定的限制。

熒光蛋白家族是在水螅綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的同源性蛋白，相對分子質(zhì)量在20到30 kD之間，包括紅色、黃色、綠色和青色熒光蛋白等。其中，GFP是應用最多的一種。GFP基因在細胞中的表達后無需裂解細胞，也不用額外添加酶底物，直接利用熒光顯微鏡或熒光分光光度計就可進行定量檢測。此外，GFP還具有對熱、極端pH和化學變性劑穩(wěn)定的優(yōu)勢。Xu等[23]構(gòu)建了雙細胞系綠色熒光蛋白表達系統(tǒng)來鑒定和研究具有雌激素受體激動劑和抑制劑活性的EDCs。由于GFP自身具有發(fā)熒光的特性，多用于在體內(nèi)報告基因的研究，如中國的香港城市大學[24]和日本的[25]研究者利用轉(zhuǎn)基因青鳉監(jiān)測類雌激素的化合物。

β-Gal是大腸桿菌乳糖操縱子中l(wèi)acZ基因編碼的產(chǎn)物，能催化各種半乳糖苷的水解。該報告基因最大的優(yōu)勢在于分析方法簡單，常規(guī)的分光光度計即可完成分析測定，且靈敏度隨不同底物而不同。利用重組酵母所建立的受體報告基因檢測方法大多選擇β-Gal作為報告基因。

Luc可以催化熒光素氧化，在氧化過程中，會發(fā)出生物熒光，最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和海腎(renilla)熒光素酶。與其他報告基因相比，熒光素酶報告基因有許多優(yōu)點。首先，哺乳動物細胞無內(nèi)源性熒光素酶，不用擔心內(nèi)源性信號的污染。其次，該報告基因檢測方法簡單、易操作、非放射性?？刹捎没瘜W發(fā)光微孔板檢測儀快速靈敏地測定熒光素酶基因的表達，非常適用于高通量篩選。此外，該方法的靈敏度很高，熒光素酶濃度在10-16到10-8mol·L-1范圍內(nèi)，熒光信號強度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測到10-20mol·L-1的熒光素酶[26]。值得指出的是，熒光素酶在哺乳動物細胞中的半衰期為僅為3 h[27]，在細胞中不會積累。上述優(yōu)點使得Luc成為最常用于哺乳動物細胞的報告基因，各大生物試劑公司相繼開發(fā)了多種Luc商品載體，為報告基因的研究提供了極大的方便。

在以上4種報告基因中，以β-Gal作為報告基因的酵母檢測最為便捷，但由于β-Gal在哺乳動物細胞中有內(nèi)源性活性，需要較高的pH值削減其活性，在哺乳動物細胞中不常使用[28]。CAT和Luc是哺乳動物細胞常用的報告基因，尤其是Luc，因上述諸多優(yōu)點而被廣泛采用。但這些報告酶基因的檢測需要裂解細胞并添加酶底物，不適用于完整細胞的檢測，如微流控細胞分析。GFP作為自發(fā)熒光的一種蛋白檢測時不需破壞細胞，可用于連續(xù)檢測。但由于GFP缺乏酶促擴大效應，其靈敏性比Luc低，較少應用在體外受體報告基因?qū)嶒炛小?/p>

此外，在以哺乳動物細胞為基礎的報告基因?qū)嶒炏到y(tǒng)中，為了減少轉(zhuǎn)染效率等系統(tǒng)誤差。常采用雙報告基因的實驗方法。即在使用螢火蟲熒光素酶的同時結(jié)合CAT、β-Gal或葡萄醛酸苷酶(GUS)等報告基因作為輔助參照。但由于這些輔助報告基因各自的檢測化學手段、操作要求和測量特點有很多不同而不夠便利。最近，一些生物公司開發(fā)了雙熒光素酶報告基因技術(shù)，將螢火蟲熒光素酶檢測和海腎熒光素酶檢測相結(jié)合，可以在單反應體系中進行雙熒光素酶報告基因的檢測，更加快速、靈敏、簡便，得到越來越多研究學者的青睞。Oka等[29]采用雙熒光素酶報告基因的方法檢測了化學物質(zhì)對3種蛙、1種魚、1種鱷魚以及人類甲狀腺激素受體的激動或抑制作用，獲得了更為可靠的核受體報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果。

1.3 宿主細胞的選擇

受體報告基因?qū)嶒灣Ｓ玫乃拗骷毎薪湍讣毎鸞9,30]、哺乳動物細胞[28]和核受體同源動物細胞[31]。酵母是單細胞低等真核生物，以此建立的重組酵母檢測系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，無內(nèi)源性激素影響，表達產(chǎn)物與天然蛋白生物活性相似等特點，此外，實驗還具有靈敏度高，操作方便，經(jīng)濟，周期短等優(yōu)點[32]。因此，重組酵母檢測系統(tǒng)是最常用的EDCs高通量初篩的方法。但是，酵母細胞缺乏類似哺乳動物細胞的代謝能力，對于一些需要經(jīng)過體內(nèi)羥化、磺化或甲基化等過程被代謝活化或滅活的EDCs在酵母檢測系統(tǒng)中有可能會出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果。而且酵母細胞的細胞壁比哺乳動物的細胞膜厚韌，通透性較差，可能影響某些化合物進入細胞的濃度，從而造成結(jié)果的偏差[33]。因此，哺乳動物細胞系也是受體報告基因?qū)嶒灣Ｓ玫囊活愃拗骷毎Ｓ糜谑荏w報告基因?qū)嶒灥牟溉閯游锛毎抵饕蠱CF-7(人乳腺癌細胞)[34]、T47D(人乳腺管癌細胞)[35]、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)[36]和HEK293(人胚腎細胞)[37]、COS(非洲綠猴腎細胞)[38]等。相比重組酵母系統(tǒng)，哺乳動物細胞能指導蛋白質(zhì)正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因此其表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面更接近天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。

值得指出的是，盡管化學性配體對核受體的轉(zhuǎn)錄激活機制相當保守，但許多細胞內(nèi)的因素(如啟動子環(huán)境、細胞環(huán)境或受體的物種來源)會對轉(zhuǎn)錄激活實驗的結(jié)果產(chǎn)生影響。有研究表明，雌激素受體介導的基因轉(zhuǎn)錄依賴輔活化因子的補充，且這些輔活化因子存在細胞或組織差異[39-40]。Xu等[23]以GFP為報告基因研究化學物質(zhì)對雌激素受體的激動或抑制效應時也發(fā)現(xiàn)，三苯氧胺和雷洛昔芬對人乳腺癌細胞MCF-7和子宮內(nèi)膜癌石川細胞的效應有顯著不同，顯示出明顯的組織差異。因此僅采用基因工程酵母細胞或哺乳動物細胞系研究化合物對不同動物核受體受體信號通路的影響是不全面的。全面而準確信息的獲得需要采用核受體同源的細胞系，構(gòu)建類似于在體狀態(tài)細胞環(huán)境的受體報告基因檢測系統(tǒng)。目前這方面的工作只見于類雌激素污染物的研究。Cosnefroy等[31]在斑馬魚肝細胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了報告基因載體ERE-βGlob-Luc-Svhygro和斑馬魚雌激素受體ERα、ERβ1和ERβ2表達載體，構(gòu)建了穩(wěn)定的報告基因檢測系統(tǒng)以評估化學物質(zhì)對水生脊椎動物的危害。

在實際的研究工作中，研究者應根據(jù)具體的研究目的選擇宿主細胞。在進行核受體干擾物篩選的實驗中，可選擇酵母或哺乳動物基因工程細胞，有利于標準化實驗操作程序，進行高通量篩選。如果研究的目的是評估某種化合物對具體某一物種或一類物種的生物學效應時，則應選取與該核受體同源的動物細胞。

2 受體報告基因?qū)嶒炘诰S甲酸和維甲酸X受體干擾物污染監(jiān)測中的應用

維甲酸(retinoic acids, RAs)也稱為視黃酸，有全反式RA(all-trans RA, atRA)和9-順RA(9-cis RA, 9cRA)2種主要的同分異構(gòu)體，是維生素A(vitamin A)的氧化代謝產(chǎn)物[9,41]。RAs及其代謝產(chǎn)物在動物的胚胎發(fā)育、器官形成、生殖等都發(fā)揮重要作用，過量或缺乏將導致胚胎畸形發(fā)育。在動物體內(nèi)RAs作為配體，可與RARs和RXRs結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子區(qū)域的特定反應元件結(jié)合，啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄而傳遞生物學信息[42]。其中atRA只與RARs結(jié)合，而9cRA能與RARs和RXRs兩種受體結(jié)合[43]。許多外源性化合物通過模擬或抑制生物體內(nèi)的天然維甲酸，從而干擾維甲酸的信號通路，對生物機體產(chǎn)生影響。對這類污染物的監(jiān)測可通過檢測RARs和RXRs核受體的轉(zhuǎn)錄活性而追蹤污染物的存在。

2.1 RARs和RXRs激動劑/抑制劑的篩選

許多內(nèi)源性化合物和異生物質(zhì)通過模擬/抑制天然維甲酸與維甲類受體(即RAR或RXR)結(jié)合，從而干擾生物體正常的維甲酸信號通路。近年來，國內(nèi)外研究學者采用受體報告基因?qū)嶒灣晒Y選了維甲類受體—RAR和RXR的激動劑和抑制劑。

Lemaire等[38]在Hela細胞轉(zhuǎn)染了表達熒光素酶的報告基因載體以及含RARs基因的表達載體，檢測有機氯農(nóng)藥艾氏劑、氯丹、狄氏劑、異狄氏劑和硫丹對人的RARα、RARβ以及RARγ的激動和抑制作用，發(fā)現(xiàn)這些化合物都能微弱地激活RARβ和RARγ，但不能激活RARα。其中，異狄氏劑激活作用最顯著，對RARβ和RARγ的50%有效濃度分別是17.6和6.0 μmol·L-1。Kamata等[9]在酵母細胞中轉(zhuǎn)染了含人RARγ的誘餌質(zhì)粒和共激活因子TIF2的靶質(zhì)粒，對543種化合物(包括工業(yè)化學品、農(nóng)藥、天然化合物、藥物和化妝品)進行評估，結(jié)果顯示有85種化學物質(zhì)，其中有16種有機氯農(nóng)藥，14種苯乙烯聚合物，9種烷基酚以及6種對羥苯甲酸酯檢測出具有RARγ激動劑作用。尤其是烷基酚與RARγ有高親和力，相當于全反式RA的0.446～1.363%。Li等[30]將表達質(zhì)粒pGBT9 hRXRβ(含GAL4 DNA結(jié)合域和hRXRβ配體結(jié)合域)以及報告基因質(zhì)粒pGAD424 GRIP1/FL(含GAL4 DNA激活域和GRIP1/FL全長)轉(zhuǎn)化至酵母中，檢測了16種化學物質(zhì)與RXR的結(jié)合活性。其中有10種化學物質(zhì)被檢測出具有RXR激動活性，15種顯示出抑制活性。最近，Kabiersch等[44]利用雌激素受體反應元件(estrogen receptor responsive elements, ERE)和螢火蟲熒光素酶報告基因構(gòu)建了BMAEREluc釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)報告菌株，并在表達載體中嵌合人RXRα的配體結(jié)合域以及人ERα的DNA結(jié)合域，以此構(gòu)建了生物發(fā)光酵母實驗(bioluminescent yeast assay)。該作者通過這一檢測系統(tǒng)證實有機錫化合物和RXR的天然配體全反式維甲酸(all-trans RA, atRA)以及9-順RA(9-cis RA, 9cRA)與RXR具有高特異性。該檢測系統(tǒng)可以在納摩爾級濃度檢測TBT和TPT(分別是30和110 nmol·L-1)，并進行小規(guī)模高通量分析。

Kamata等[9]和Kanayama等[45]的研究表明相比維甲類受體(RARs和RXRs)的天然配體atRA或9-cRA，絕大多數(shù)異生性化合物對RARs/RXRs的激動/抑制作用是非常小的。因此，這些污染物質(zhì)在正常的環(huán)境濃度內(nèi)干擾大多數(shù)生物的RARs/RXRs的信號通路的可能性較低，不致對生物造成不利影響。但是，一些異生性化合物如有機氯農(nóng)藥性質(zhì)極為穩(wěn)定，能夠在生物組織中積累，通過食物鏈產(chǎn)生生物放大作用。所以盡管它們的RARs/RXRs激動/抑制作用微弱，但如果在胚胎發(fā)育期間暴露在這樣相對較高的異生性物質(zhì)環(huán)境當中，同樣可能對生物造成不利影響[46]。而且，有些維甲酸和維甲酸X受體干擾物的毒性效應不容忽視，如有機錫化合物在納克級濃度水平[47-48]就可導致腹足類產(chǎn)生性畸變，也是哺乳動物潛在的肥胖激素[49]，同時對魚類和兩棲類具有較強的致畸效應。Fent等[50]研究TPT對鱥魚(Phoxinus phoxinus)不同早期發(fā)育階段的影響結(jié)果顯示，TPT的暴露會導致其幼體骨骼畸形(彎尾)，運動能力降低。Shi等[51]研究TBT對兩棲類熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎的影響時發(fā)現(xiàn)，TBT的濃度在12.5～200 ng·L-1(4.6～73 ng Sn·L-1)(接近環(huán)境相關(guān)濃度)時會抑制熱帶爪蟾的變態(tài)，干擾性腺的分化。介于這些化學物質(zhì)的不利影響，需要我們對其在環(huán)境樣品中的污染情況進行跟蹤監(jiān)測。

2.2 環(huán)境樣品中維甲酸和維甲酸X受體干擾物的監(jiān)測

受體報告基因?qū)嶒灢粌H應用在RARs和RXRs激動劑和抑制劑的篩選，越來越多的學者也將這種方法用以監(jiān)測環(huán)境樣品中維甲酸和維甲酸X受體干擾物的污染。

Gardiner等[52]最先在天然的水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)RAR激動活性。他們在美國2條河流中發(fā)現(xiàn)RARα激動活性的存在，認為這些RAR激動劑的存在也可能是導致這些流域頻繁出現(xiàn)畸形蛙的原因。Inoue等[53]從日本4條河流中采集16個水樣，采用酵母雙雜交的方法檢測其對人的5種核受體，包括雌激素受體(estrogen receptor α, ERα)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor α, TRα)、RARα、RXRα和維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)的激動活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有8、15、6、6和9個樣品分別對ERα、RARα、TRα、RXRα和VDR這5種核受體具有顯著的激動活性(P<0.05)，表明河流已被核受體干擾物污染，并發(fā)現(xiàn)RAR激動劑污染比ER激動劑污染更嚴重。隨后，他們又在日本2條河流中分別設20個站位，在不同季節(jié)采集水樣，采用同樣的方法來研究河流中RAR激動劑的時空變化并調(diào)查河流中潛在的RARα激動劑污染來源。他們發(fā)現(xiàn)這2條河流中存在2種高活性的未知RARα激動劑，既不是RAs也不是4-oxo-RAs，而是2種未知的化合物。并且RARα激動劑污染物的空間變化模式與ERα激動劑污染物的完全不同。眾所周知，污水處理廠是ERα激動劑污染物的主要來源，因此作者提出污水處理廠的排出水不是RARα激動劑的主要來源[54]。接著，他們同樣采用酵母雙雜交的方法，又檢測了日本7家污水處理廠中處理的和未處理的水樣對4種核受體(雌激素受體α、甲狀腺激素受體α、維甲酸受體α和維甲酸X受體α)的激動活性，在所有水樣中都被檢測出對以上4種核受體有激動活性。而后他們對通過不同的生物處理工藝的污水進行檢測，發(fā)現(xiàn)激動活性有減小，但并沒有完全去除[55]。Zhen等[56]也利用酵母雙雜交技術(shù)對北京7家污水處理廠及其接收河流樣品中的RAR激動活性進行檢測，并對水樣通過高效液相色譜分離后用質(zhì)譜分析，確定RAR激動劑是全反式4-氧代-RA(all-trans-4-oxo-RA)和13-順式-4-氧代-RA(13-cis-4-oxo-RA)這2種化學物質(zhì)。李劍等[57]將含有RXR基因的酵母表達質(zhì)粒pGBT9-RXRβ和含有GRIP1基因的酵母表達質(zhì)粒pGAD424-GRIP1共轉(zhuǎn)染至酵母細胞Y187而構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選對維甲酸X受體產(chǎn)生干擾的化合物，并對水廠進出水樣的維甲酸X受體干擾效應進行檢測。發(fā)現(xiàn)三丁基錫乙酸鹽是激動劑，而Aroclor1254(多氯聯(lián)苯混合物)是拮抗劑；水廠進水樣品抑制9cRA誘導的酶活性，說明進水樣品中含有RXR拮抗劑；但出水樣品并沒有檢測出對9cRA誘導酶活性的抑制效應，說明該廠的現(xiàn)行處理工藝可以較好地去除水中RXR拮抗劑。隨后，他們應用已構(gòu)建的RXR-GRIP1雙雜交酵母檢測系統(tǒng)篩選南方某污水處理廠不同工藝出水的維甲酸干擾活性，并結(jié)合大鼠肝均漿(S9)體外代謝方法檢測樣品的間接維甲酸干擾活性。結(jié)果表明在城市污水中存在大量具有類/抗維甲類干擾活性的化合物[58]。Jiang等[8]在中國的6條主要河流以及3家飲用水處理廠采取水樣，通過酵母雙雜交技術(shù)檢測其RXR激動活性或抑制活性。結(jié)果在所有的樣品中都可以顯著觀察到RXR的拮抗活性卻沒有發(fā)現(xiàn)RXR激動活性。

從Gardiner[52]發(fā)現(xiàn)水域中存在維甲酸干擾物污染開始，越來越多的學者通過不同的體外檢測方法，對天然河流流域以及飲用水源和排出的污水，甚至沉積物和空氣樣品[59-60]進行監(jiān)測，都檢測到RARs或RXRs的激動或抑制活性，這說明維甲酸和維甲酸X受體干擾物在環(huán)境樣品中是廣泛存在的。但到目前為止，只有Zhen等[56]鑒定出7家污水處理廠及其接收河流中RAR激動劑污染物是全反式4-氧代-RA和13-順式-4-氧代-RA。有機錫造成腹足類性畸變的嚴重后果提醒我們，維甲酸和維甲酸X受體干擾物的危害，尤其是對某些敏感物種的危害是相當嚴重的，非常有必要深入廣泛的進行維甲酸和維甲酸X受體干擾物的調(diào)查研究，以更好地了解環(huán)境樣品中維甲酸和維甲酸X受體干擾物的污染情況，鑒定并跟蹤這類污染物在環(huán)境樣品中的狀態(tài)和歸宿，以詳實豐富的信息切實評估其可能存在的生態(tài)風險。

3 受體報告基因?qū)嶒炘诰S甲酸和維甲酸X受體干擾物作用機制研究中的應用

受體報告基因?qū)嶒?，不僅是高通量的篩選RARs和RXRs的激動劑和抑制劑以及跟蹤檢測環(huán)境樣品中維甲酸和維甲酸X受體干擾物污染的有效工具，還可用于研究這類干擾物的作用機制。有機錫致腹足類性畸變的分子機制一直以來眾說紛紜，沒有定論。腹足類RXR基因的克隆與功能研究表明，性畸變與RXR信號通路密切相關(guān)，其中報告基因?qū)嶒灩Σ豢蓻]。

Urushitani等[61]采用熒光素酶報告基因在cos-1細胞的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)中研究了機錫化合物與疣荔枝螺(Thais clavigera)2種亞型的RXR，包括TcRXR-1和TcRXR-2的結(jié)合情況，探討了有機錫化合物誘導腹足類性畸變的分子機制。他們的研究顯示9cRA以及有機錫化合物三丁基氯化錫和三苯基氯化錫分別在濃度為10-8、10-8和10-7mol·L-1時能顯著提高TcRXR-1的轉(zhuǎn)錄活性，并發(fā)現(xiàn)TcRXR-2和TcRXR-1對9cRA的反應存在差異，推測二者可能具有不同的分工。最近，該課題組再次利用報告基因?qū)嶒?包括哺乳動物細胞單雜交實驗和雙雜交實驗)研究atRA對疣荔枝螺維甲酸受體(TcRAR)類似蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響，并未觀察到該蛋白的配體依賴型轉(zhuǎn)錄活性，只有在TcRAR和TcRXR同時存在時才能檢測到轉(zhuǎn)錄活性，表明TcRAR不能被維甲酸和維甲酸受體干擾物激活，但是能與TcRXR形成異源二聚體[62]，即該類污染物很可能是通過與TcRXR結(jié)合，TcRXR與TcRAR形成異源二聚體。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，受體報告基因?qū)嶒灆z測水環(huán)境中維甲酸和維甲酸X受體干擾物具有快速、靈敏的優(yōu)勢，可為檢測污染物潛在的內(nèi)分泌干擾毒性以及初篩釋放到環(huán)境中的化學物質(zhì)的安全性提供有效工具。目前被廣泛應用于篩選類雌激素、類雄激素等內(nèi)分泌干擾物的報告基因?qū)嶒灧ㄔ诰S甲酸和維甲酸X受體干擾物的監(jiān)測和篩選方面，尚處于起步階段，對環(huán)境樣品中維甲酸和維甲酸X受體干擾物的檢測研究也非常有限，有必要擴大篩選范圍和研究水域，豐富該類化合物的相關(guān)背景分布的信息。

值得指出的是，大多數(shù)核受體報告基因的體外檢測系統(tǒng)都是以人類或鼠等哺乳動物源的核受體為研究對象，但人類的研究結(jié)果并不能夠簡單的適用于野生動物。研究表明，盡管人和黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)AR的配體結(jié)構(gòu)域相似性很高，EDCs的親和性仍在哺乳動物和魚類有所不同，表明同樣的EDCs對不同物種的影響極可能不同[63-64]。同樣的差異在比較增塑劑與ER的親和性研究中也被發(fā)現(xiàn)[65]。Katsu等[66]研究發(fā)現(xiàn)4種兩棲動物的雌激素受體對天然雌激素以及環(huán)境化學物質(zhì)靈敏性存在物種差異。Oka等[29]以3種蛙、1種魚、1種鱷魚以及人類的甲狀腺激素受體建立瞬時轉(zhuǎn)錄激活檢測系統(tǒng)來篩選潛在具有甲狀腺激素受體活性和抗甲狀腺激素受體活性的化學物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)10-5mol·L-1四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)會抑制T3激活青鳉TRα的轉(zhuǎn)錄能力，然而在其他物種中并沒有發(fā)現(xiàn)。李維等[67]比較不同物種RXR的配體結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)軟體動物和人類RXR相似度很高(>93%)，但和果蠅RXR同系物超氣門蛋白(ultraspiracle, UPS)的相似性僅為44%，這表明其配體會有很大的不同。要全面地綜合評價核受體干擾物的環(huán)境生態(tài)安全，只有哺乳類或魚類的數(shù)據(jù)是遠遠不夠的。來自不同分類地位物種數(shù)據(jù)的加入，將大大提高報告基因體外檢測系統(tǒng)的可靠性和應用范圍[68]。

此外，在維甲酸和維甲酸X受體干擾物的作用機制研究方面，也有許多工作尚待開展。哺乳動物的研究表明，RXR可與很多核受體形成異源二聚體而發(fā)揮多種生物學功能。維甲酸X受體干擾物的典型代表有機錫，對腹足類和哺乳動物毒性效應明顯不同，前者是性畸變，后者是致肥胖，可能與哺乳動物RXR另一重要配體過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)的參與密切相關(guān)。研究者可應用受體報告基因?qū)嶒?，研究RXR與不同受體之間的相互作用以及各種輔調(diào)因子的調(diào)節(jié)機制，探討該類污染物對不同生物的毒性機制。

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ReceptorReporterGeneAssayandItsApplicationinMonitoringofChemicalswithAntagonistorAgonistEffectstoRetinoicAcidReceptorsandRetinoidXReceptors

Zhong Enhui, Wang Yilei, Wang Shuhong*

Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China

12 September 2013accepted15 December 2013

Receptor reporter gene assay has been widely applied in high-throughput screening of environmental endocrine disrupting chemicals, on account of its advantages of rapid, economic, sensitive and convenient measurement. Some chemicals like organotin have shown antagonist or agonist effects to RAR (retinoic acid receptors) and/or RXR (retinoid X receptors), which make the usage of receptor reporter gene assay possible in this field. There are several reports about the screening and detection of these chemicals. Here, we reviewed the technology of receptor reporter gene assay, including the reporter gene and host cell selection, as well as its applications in screening and monitoring of chemicals with antagonist or agonist effect to RAR and/or RXR. The present review also discussed what should be done to improve the application of receptor reporter gene assay in order to provide some new insight in this field.

receptor reporter gene assay; retinoic acid receptor (RAR); retiniod X receptor (RXR)

國家自然科學基金(20877034)；福建省科技重點項目(2011N0022)；集美大學創(chuàng)新團隊基金(2010A001)

鐘恩惠(1988-)，女，碩士，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: grace88zhong@gmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: shwang@jmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130912002

鐘恩惠，王藝磊，王淑紅. 受體報告基因?qū)嶒灱捌湓诰S甲酸和維甲酸X受體監(jiān)測中的應用[J]. 生態(tài)毒理學報, 2014, 9(2): 319-328

Zhong E H，Wang Y L, Wang S H. Receptor reporter gene assay and its application in monitoring of chemicals with antagonist or agonist effects to RAR and RXR [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 319-328 (in Chinese)

2013-09-12錄用日期2013-12-15

1673-5897(2014)2-319-10

X171.5

A

王淑紅(1969—)，女，理學博士，副教授，主要研究方向為水生生態(tài)毒理學和水產(chǎn)動物生理學。