張 超，趙 芊，張 哲，宋水山

(1. 河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130； 2. 河北省科學(xué)院 生物研究所，石家莊 050081；3. 河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081)

植物擁有一套免疫系統(tǒng)以應(yīng)對病原物的侵染。植物主要通過兩種方式進(jìn)行自身防衛(wèi)以對抗病原體侵襲。第一種方式，即病原相關(guān)分子模式(PAMPs)觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)[1]，如細(xì)菌鞭毛蛋白flg22和延伸因子Tu elf18，這些PAMPs分別由不同的受體激酶特異性識別，激活多種信號傳遞事件，啟動廣泛非特異性免疫反應(yīng)。為了抵御這種基礎(chǔ)防御，病原體產(chǎn)生一系列的效應(yīng)子(effectors)進(jìn)入植物細(xì)胞從而觸發(fā)植物第二種防御方式，即病原效應(yīng)物觸發(fā)的免疫效應(yīng)(ETI)，起始于相應(yīng)的植物抗性蛋白特異性識別病原體效應(yīng)子，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)(HR)，使感染部位周圍的植物細(xì)胞凋亡，從而阻止病原體在植物細(xì)胞中的進(jìn)一步擴(kuò)散[2]。在這些防衛(wèi)反應(yīng)中，Ca2+-CaM信號系統(tǒng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

Ca2+是一種普遍存在的第二信使，多種信號刺激如光、溫度、干旱、鹽、病原體等均可引起植物細(xì)胞Ca2+濃度上升，不同的刺激賦予Ca2+信號不同的特征，從而引起植物細(xì)胞產(chǎn)生對應(yīng)的生理反應(yīng)[3]。Ca2+信號的這種刺激特異性源于細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)膜系統(tǒng)上離子通道及泵對Ca2+流的嚴(yán)格控制[4]。特定的Ca2+信號由Ca2+結(jié)合蛋白至下游效應(yīng)子引起的細(xì)胞反應(yīng)。

Ca2+結(jié)合蛋白主要包括3個亞家族：鈣調(diào)素(CaM)和鈣調(diào)素類蛋白(CMLs)、Ca2+依賴蛋白激酶(CPKs)、鈣調(diào)素B類蛋白(CBLs)及其相互作用蛋白[5]。CaM廣泛存在于所有真核生物中，在進(jìn)化上高度保守，而CMLs、CPKs以及CBLs僅存在于植物和原生生物中[6]。Ca2+作為一種多功能第二信使參與植物的多種生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)過程，有關(guān)Ca2+信號系統(tǒng)已經(jīng)在植物生物學(xué)的許多領(lǐng)域得到詳細(xì)研究。本文主要就植物—病原體相互作用中Ca2+-CaM信號系統(tǒng)在調(diào)節(jié)植物免疫過程中的作用做一綜述，包括Ca2+信號產(chǎn)生和相關(guān)組分的基因表達(dá)調(diào)控。

1 植物免疫中的Ca2+信號

1.1 Ca2+流及Ca2+通道

植物細(xì)胞識別病原體的早期信號事件之一就是Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞質(zhì)。利用轉(zhuǎn)水母發(fā)光蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥研究發(fā)現(xiàn)，接種病原菌丁香假單胞菌(Pst)后，胞質(zhì)游離Ca2+濃度快速上升，并且在處理10 min后達(dá)到最大值。如接種無致病能力的Pst可觸發(fā)HR，并引起細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平的二次增加，而接種毒性菌株無此現(xiàn)象。利用Ca2+通道抑制劑LaCl3阻止Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致HR被抑制，說明Ca2+在ETI中發(fā)揮重要作用。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)是革蘭氏陰性細(xì)菌胞間通訊的信號分子，近年的研究表明AHLs能介導(dǎo)原核細(xì)菌與其真核寄主之間的信息交流，張哲等[7]利用N-3-羰基辛?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-3-oxo-octanoyl-homoserine lactone, 3OC8-HSL)處理擬南芥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)游離Ca2+濃度瞬時升高，此外3OC8-HSL可以激活質(zhì)膜Ca2+通道, 增加胞外Ca2+內(nèi)流。利用不同的PAMPs如flg22、elf18以及其它植物防御誘導(dǎo)子處理植物進(jìn)行相似的研究，發(fā)現(xiàn)不同PAMPs和誘導(dǎo)子誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)Ca2+發(fā)生不同變化[8]。并且這種特異性變化不僅發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，同時也發(fā)生在細(xì)胞核、線粒體或者葉綠體中，表明整合了所有細(xì)胞器構(gòu)建植物防御系統(tǒng)[9,10]。

為了解調(diào)控Ca2+通道的關(guān)鍵組分，Ranf等利用化學(xué)誘變劑處理轉(zhuǎn)水母發(fā)光蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥，制備突變體庫，用于分離flg22處理后表現(xiàn)出Ca2+信號混亂現(xiàn)象的突變體植物[14]。根據(jù)突變體的Ca2+信號表型，分離篩選PTI中可能參與調(diào)控Ca2+信號的關(guān)鍵因子。環(huán)核苷酸門控通道(CNGCs)是控制Ca2+穿過細(xì)胞膜的非選擇陽離子通道[11]。突變擬南芥中CNGC2或者CNGC4基因?qū)е翲R反應(yīng)減弱[12]。另外，利用cngc2突變體研究表明CNGC2在植物—病原體相互作用過程中促進(jìn)胞外Ca2+的內(nèi)流。ACAs是自我抑制型Ca2+-ATP酶，負(fù)責(zé)Ca2+的外流。破壞擬南芥Ca2+—ATP酶(ACA)家族中的一些成員，植物免疫會發(fā)生改變。擬南芥含有14種ACA，其中有10種位于不同細(xì)胞膜上。將液泡膜上的Ca2+泵ACA4和ACA11敲除可導(dǎo)致高頻率的HR樣壞死斑發(fā)生率顯著提高，這種現(xiàn)象可能是由防衛(wèi)水楊酸(SA)濃度升高引起的。破壞位于細(xì)胞質(zhì)膜上的ACA8或者ACA10使植物對Pst毒性菌株的敏感性增強(qiáng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌處理的包括ACA12和ACA13在內(nèi)的其它ACAs的表達(dá)也被誘導(dǎo)，說明在病原菌感染過程中ACAs的其它成員也參與Ca2+的穩(wěn)態(tài)調(diào)控[14]。以上這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明病原體刺激植物時，Ca2+通道和Ca2+泵調(diào)控Ca2+流的變化，而擾亂Ca2+穩(wěn)態(tài)能夠影響植物的防衛(wèi)反應(yīng)。

1.2 CaM調(diào)節(jié)Ca2+通道活性

CaM在調(diào)節(jié)Ca2+通道和Ca2+泵的過程中起重要作用。CaM同時調(diào)節(jié)CNGCs和ACAs,猜測CaM可能在Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中處于中心位置。CaM激活環(huán)核苷酸產(chǎn)生，環(huán)核苷酸激活CNGCs，而CNGCs又可與CaM結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)與環(huán)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)有部分的重疊。CaM的結(jié)合干擾了環(huán)核苷酸的結(jié)合從而導(dǎo)致CNGCs失活。因此CaM反饋抑制CNGCs活性，阻止Ca2+內(nèi)流。ACAs屬Ca2+-ATP酶的亞族，受CaM調(diào)節(jié)，其N端含有CaM結(jié)合域和自抑制域[15]。CaM通過阻止ACAs的自我抑制從而激活Ca2+泵。ACAs活性也可以被N末端磷酸化作用所抑制。在ACA8中，存在于CaM結(jié)合域周圍的一些絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化作用之后，CaM的誘導(dǎo)活性明顯降低[16]。此外，蛋白激酶可能參與ACAs的調(diào)節(jié)。flg22處理擬南芥，ACA8和ACA10均發(fā)生不同程度的磷酸化作用，還發(fā)現(xiàn)ACA8可以和flg22受體激酶(FLS2)組成復(fù)合體，說明鞭毛感知系統(tǒng)可能直接調(diào)控Ca2+泵[17]。有研究表明，幾種Ca2+依賴蛋白激酶是植物響應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子。ACAs是否是Ca2+依賴蛋白激酶的作用底物有待證實(shí)。ACAs的激活和失活是通過兩種不同的Ca2+感受蛋白調(diào)控的，進(jìn)一步說明了Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)反饋控制中Ca2+的重要性。

2 植物免疫中CaM亞型和CMLs的功能

2.1 CaM/CML參與植物免疫

與動物不同，植物基因組一般含有編碼一些典型CaM亞型的CaM基因以及CaM類蛋白(CMLs)的基因。例如擬南芥基因組中含有9個CaM基因和50個CMLs基因。越來越多的證據(jù)表明下調(diào)CaM/CMLs基因表達(dá)或CaM/CMLs功能缺失會嚴(yán)重影響植物的免疫機(jī)能。下調(diào)煙草中受病原物誘導(dǎo)的CaM亞型基因，如NtCaM1，NtCaM13表達(dá)量，在不同程度上影響煙草的抗病性。沉默NtCaM13使煙草對病毒、病原細(xì)菌和真菌的感病性增加，而缺失NtCaM1對煙草的抗病性無影響。過表達(dá)辣椒CaM1激活活性氧和NO產(chǎn)生，誘導(dǎo)HR和防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)導(dǎo)致對病原細(xì)菌的局部抗性[18]。敲除西紅柿中的CML基因APR134導(dǎo)致HR受到抑制，然而過表達(dá)擬南芥中APR134同源基因CML43則增強(qiáng)HR。擬南芥CML24敲除突變體對Pst無毒株的HR反應(yīng)明顯減弱，同時當(dāng)用PAMPs之一的脂多糖處理時該突變體體內(nèi)NO的產(chǎn)生明顯減少[19]。擬南芥CML9突變植株和過表達(dá)植株的研究表明CML9在植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其它遺傳學(xué)研究表明煙草CML蛋白rgs-CaM(基因沉默的調(diào)節(jié)子)在植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中通過調(diào)節(jié)RNA沉默起作用[20]。這些研究結(jié)果為CaM亞型和CMLs參與植物免疫提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

2.2 CaM及其結(jié)合蛋白

蛋白互作分析表明CML9可以像CaM一樣與許多轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種蛋白相互結(jié)合[21-23]。其中部分蛋白是特異性結(jié)合CML9以及與CMLs密切相關(guān)的蛋白，而另外部分蛋白還可與CaM結(jié)合。WRKYs和TGAs是與植物抗病相關(guān)的兩類轉(zhuǎn)錄因子，CML9與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，但是CML9對其活性的影響還不清楚。與細(xì)胞自噬相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶ATG4是一種專一結(jié)合CML24的蛋白[24]。對比分析cml24突變體和野生型中ATG4的活性表明CML24在調(diào)節(jié)ATG活性方面有重要作用。敲除atg的突變體其HR反應(yīng)受抑制，與cml24的表型一致[25]，猜測ATG4b可能是HR中CML24的靶標(biāo)蛋白。當(dāng)植物受到病毒侵染時，植物RNA沉默機(jī)制誘導(dǎo)啟動，將病毒雙鏈RNA裂解為短鏈干擾RNA，進(jìn)而沉默病毒RNA的表達(dá)[26]。然而另一方面，病毒通過病毒RNA沉默抑制子(RSSs)與siRNA的結(jié)合阻止病毒RNA的沉默，從而削弱植物的防衛(wèi)反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)煙草CML(rgs-CML)不僅參與病毒誘導(dǎo)的植物RNA沉默機(jī)制，而且可以與人相互作用。在煙草細(xì)胞中rgs-CaM可以檢測到病毒RSSs，并與其直接結(jié)合，從而抑制了siRNA與RSSs的相互結(jié)合，促進(jìn)RSSs自身降解，增強(qiáng)植物防衛(wèi)反應(yīng)。這些結(jié)果表明介導(dǎo)的植物免疫可以通過結(jié)合蛋白與病原菌相互作用而完成。

2.3 CaM亞型及其轉(zhuǎn)錄因子

植物防衛(wèi)系統(tǒng)的構(gòu)建依賴于大量基因的表達(dá)發(fā)生變化以使細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)成為優(yōu)勢功能，而這需要許多轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的協(xié)同作用使基因轉(zhuǎn)錄重編程協(xié)調(diào)一致[27]。Galon等已在多種DNA結(jié)合蛋白家族中分離鑒定出CaM結(jié)合TFs，包括植物特有的TF家族[28]。功能分析表明，一些CaM結(jié)合TFs在植物免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。例如一些CaM結(jié)合TFs參與Ca2+信號和水楊酸(SA)介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[30]。ICS1和EDS1是參與SA的生物合成，病原菌誘導(dǎo)這兩種基因表達(dá)量上調(diào)，產(chǎn)生SA。研究發(fā)現(xiàn)CaM結(jié)合TFs分別正負(fù)調(diào)控ICS1和EDS1的表達(dá)。CBP60g是植物特有的CaM結(jié)合TFs，敲除cbp60g的突變體表現(xiàn)出病原菌誘導(dǎo)的SA產(chǎn)生量減少和ICS1表達(dá)量降低，同時對Pst的敏感性增強(qiáng)[31]。利用不能與CaM結(jié)合的突變的CBP60g互補(bǔ)cbp60g突變體，并不能恢復(fù)SA的產(chǎn)生和防衛(wèi)反應(yīng)，表明CaM在CBP60g控制可SA合成和防衛(wèi)反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。另有研究表明，CBO60g和同一TFs家族的另一成員SARD1在植物感染病原菌后，可以結(jié)合到ICS1基因的啟動子區(qū)域，說明TFs直接調(diào)控ICS1轉(zhuǎn)錄[32]。EDS1是另一種正調(diào)節(jié)SA水平的基因，受CaM結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子CAMTA3的負(fù)調(diào)控EDS1的表達(dá)。植物缺失CAMTA3，SA水平上升，EDS1表達(dá)量增多并表現(xiàn)組成性防衛(wèi)反應(yīng)[33]。 類似于CBP60g，CAMTA3控制SA產(chǎn)生和防衛(wèi)反應(yīng)需要結(jié)合CaM。此外，CAMTA3可以結(jié)合到EDS1的啟動子區(qū)域抑制其表達(dá)。以上結(jié)果顯示CaM結(jié)合TFs對涉及SA合成的兩個基因具有不同的調(diào)節(jié)作用，是病原菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SA的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。這樣Ca2+/CaM信號系統(tǒng)既可以促進(jìn)SA合成以及依賴SA的防衛(wèi)反應(yīng)，同時防止出現(xiàn)激素過量積累導(dǎo)致的有害效應(yīng)。最近研究報道了其它CaM結(jié)合TFs在植物防衛(wèi)反應(yīng)中也具有正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控的作用，例如TGA、WRKY、MYB和NAC家族中的部分成員，但是CaM對這些TFs功能的影響卻知之甚少[28,30]?？傊?，CaM正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)，表明CaM在調(diào)節(jié)植物免疫中具有關(guān)鍵性作用。

3 結(jié)論和展望

盡管科學(xué)家們對植物CaM進(jìn)行了多年的研究，但對植物中CaM/CML介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還知之甚少。近年通過對基因敲除突變體表型分析的方法明確了個別CaM亞型和CMLs的部分生物學(xué)功能。但由于植物中CMLs的多樣性，要了解每種CML的生物學(xué)功能是很困難的。利用基因表達(dá)分析、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位以及靶標(biāo)蛋白的分離鑒定將會為鑒定CMLs不同功能和在Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用提供有價值的信息。鑒于CaM/CML家族的不同成員以及其它種類的Ca2+結(jié)合蛋白(CPKs、CBLs等)經(jīng)常在相同生理過程中起作用，需要進(jìn)一步探究這些Ca2+信號系統(tǒng)是如何相互聯(lián)系的。此外，Ca2+信號途徑也與其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互關(guān)聯(lián)，因此信號與激素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)已成為研究熱點(diǎn)。

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