鄧冠軍 , 湯明禮 , 張 旋, 黃勝威, 吳麗芳

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230039； 2. 中國(guó)科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)局能源林研究中心, 合肥 230031)

黃連木(PistaciachinensisBunge)屬于漆樹(shù)科黃連木屬落葉喬木，在中國(guó)廣泛分布。其種子平均含油率約35.05%，出油率為20%～30%[1]，具有開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)食用油的潛質(zhì)[2]。黃連木樹(shù)皮、樹(shù)葉均可入藥[3]，果實(shí)、果柄和葉富含揮發(fā)油，對(duì)植物病原真菌具有一定的抑制作用[4]。此外，黃連木樹(shù)各部分都有特殊氣味，熬制的水溶液是較好的農(nóng)藥，可殺各種水稻害蟲(chóng)和蚜蟲(chóng)。研究顯示，黃連木的不同部位都富含多酚類物質(zhì)[5]。因此針對(duì)黃連木葉進(jìn)行多酚提取分離研究，并挖掘其生物活性，為進(jìn)一步提高對(duì)黃連木的綜合利用提供理論和技術(shù)支撐。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是很多疾病的病理發(fā)生的一個(gè)重要因素，比如腫瘤、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的疾病等,當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、DNA和其它生物分子都有很大的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞喪失整體性和一些功能。植物提取物具有廣泛地生物活性，其中抗氧化活性與延遲衰老和抗腫瘤等密切相關(guān)。本文采用經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速可靠的方法(DPPH和FRAP法)對(duì)純化后產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)與人類基因有60%～80%同源[6]，很多生物學(xué)基礎(chǔ)和哺乳類動(dòng)物也高度一致，而且生活史短。因而，秀麗隱桿線蟲(chóng)經(jīng)常被用作抗氧化、衰老和環(huán)境毒理等研究及藥物靶位點(diǎn)的篩選[7-9]。本文以線蟲(chóng)為活體模型，對(duì)黃連木葉純化多酚的體內(nèi)抗氧活性進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)，為黃連木葉多酚應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為提高能源林的經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

黃連木葉片2012年8月份采集于合肥市郊區(qū)，采集后殺青處理并60℃烘干，粉碎過(guò)篩(直徑為0.25 mm)。-20℃保存。

提取試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?00～300目硅膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。2，7二氯熒光素二乙酸(2，7-Dichlorofluorescein diacetate)，胡桃醌(Juglone)，1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra X-22R 離心機(jī)(Sigma)，UV-2550型紫外線可見(jiàn)光光度計(jì)(SHIMADZU)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SZM45-B2體視顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 供試樣品的制備黃連木葉粗多酚提取參考張旋等方法[10]。粗多酚的純化參考Tang 等[11]的方法：稱40 g硅膠粒(200～300目)，在105℃干燥30 min。將硅膠粒轉(zhuǎn)移到100 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)浸泡30 min，濕裝柱法裝柱(2.5 cm/73 cm)。 將0.40 g粗多酚溶于5 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)，混勻后上樣，用200 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)進(jìn)行洗脫，流速為1秒2滴，收集洗脫液1.50 mL每管，共150 mL。將收集洗脫液用福林酚法(Folin-Ciocalteau法)檢測(cè)樣品中的多酚，發(fā)現(xiàn)多酚主要集中從30 mL到120 mL洗脫液中，共收集90 mL，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其蒸干成粉末即得到黃連木葉純化多酚。

1.3.2 多酚含量測(cè)定采用福林酚法 (Folin-Ciocalteau法)[12]。單寧含量的測(cè)定參照李靜等[13]的方法。黃酮含量的測(cè)定參照裴詠萍等[14]的方法。DPPH法測(cè)定黃連木葉多酚清除自由基能力參考王晶等[15]的方法。 FRAP法測(cè)定黃連木葉多酚抗氧化活性參考Benzie等[16]的方法。

1.3.3 黃連木葉多酚提高線蟲(chóng)存活率 參考Hsu等[17]的方法。將同步化L1期N2線蟲(chóng)培育于S-液體培養(yǎng)基，加入0.50 mL 大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) OP50。然后分別加入不同濃度純化多酚(0，100，200 μg/mL)。20℃培育72 h，3300 r/min離心2 min。將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到250 μmol/L胡桃醌(Juglone)溶液中，20℃處理200 min，24 h后計(jì)數(shù)線蟲(chóng)的存活率。重復(fù)3次。

1.3.4 黃連木葉多酚對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的抑制效應(yīng)

參考Hsu等[17]的方法。線蟲(chóng)培養(yǎng)和樣品處理同1.3.3。將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到150 μmol/L 胡桃醌溶液中20℃處理1 h，M9離心洗滌2次。將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到10 μmol/L的2，7二氯熒光素二乙酸溶液，20℃處理30 min。隨機(jī)挑出線蟲(chóng)放在載玻片上，5 mM鹽酸左旋咪唑(Levamisole) 麻醉，熒光體視顯微鏡觀察拍照(曝光時(shí)間4 s)。Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)分析線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度，ANOVA法(SPASS 16.0)顯著性檢驗(yàn)。選取P< 0.05為顯著水平，線性回歸方程計(jì)算IC50(為清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度)。樣品純化率=(A1-A0)/A0*100%。(A0為黃連木葉粗多酚成分的測(cè)定參數(shù)，A1為黃連木葉多酚成分的測(cè)定參數(shù))

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連木葉粗多酚純化

本文采用二元洗脫法，并根據(jù)薄層層析預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選系統(tǒng)液以達(dá)到較好的多酚富集。黃連木葉粗多酚樣品0.4000 g經(jīng)過(guò)硅膠柱得到0.2330 g純化產(chǎn)物，純化得率為58.25%。

2.2 純化產(chǎn)物的多酚含量

采用Folin-Ciocalteau比色法測(cè)定黃連木葉多酚的多酚含量，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，其結(jié)果見(jiàn)表1。純化前后的總酚含量分別為0.8400 g和1.0125 g當(dāng)量沒(méi)食子酸每克樣品，純化后多酚含量提高了20.54%。根據(jù)硅膠粒對(duì)不同極性物質(zhì)具有不同吸附力能力，收集多酚含量高洗脫部分，從而使多酚類物質(zhì)富集，與色素類等物質(zhì)分離[18]。因此，經(jīng)過(guò)硅膠柱純化后酚類物質(zhì)的含量得到提高。

2.3 純化產(chǎn)物的單寧含量

采用福林酚-丹尼斯法(Folin-Denis法)測(cè)定單寧含量，以單寧酸為對(duì)照品，其結(jié)果見(jiàn)表1。黃連木葉多酚純化前后的單寧含量分別為0.7575 g和0.8600 g當(dāng)量單寧酸每克樣品，單寧含量提高了13.53%。通過(guò)硅膠柱純化后，黃連木葉提取物中酚類物質(zhì)的含量提高，而單寧與多酚類物質(zhì)的極性很接近，即和硅膠粒的吸附能力也差不多，因而在純化多酚類物質(zhì)同時(shí)也在富集單寧。

表1 黃連木葉提取物純化前后總酚、單寧和總黃酮的含量

2.4 純化產(chǎn)物的黃酮含量

采用三氯化鋁法測(cè)定黃連木葉多酚中黃酮含量，以蘆丁為對(duì)照品，結(jié)果見(jiàn)表1。黃連木葉多酚純化前后的黃酮含量分別為0.1297 g和0.1453 g當(dāng)量蘆丁每克樣品，黃酮提高12.03%。本文主要目的旨在提高提取物的多酚含量，未對(duì)不同性質(zhì)的多酚成分進(jìn)行分級(jí)分離。黃酮作為多酚的一部分，通過(guò)硅膠柱純化后，其含量自然也隨著黃連木葉純化產(chǎn)物中多酚類物質(zhì)的含量增加而提高[19]。

圖1 維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚對(duì)DPPH·清除作用

2.5 純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力

黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除能力見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化產(chǎn)物清除DPPH自由基能力強(qiáng)于黃連木葉粗多酚，也強(qiáng)于維生素C(Vitamin C)，但微弱于98%茶多酚。DPPH自由基清除率與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)，說(shuō)明酚類物質(zhì)在DPPH自由基清除過(guò)程中起到主要作用。黃連木多酚的清除能力沒(méi)有茶多酚強(qiáng)，可能由于純化后黃連木多酚的純度仍然沒(méi)有達(dá)到商品化茶多酚的純度。另外，DPPH自由基的清除率還與其中所含有酚類化合物的種類和極性有關(guān)，中等極性的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率較高。兩種提取物的清除能力差異也可能是所含酚類的極性不一樣導(dǎo)致的[20]。IC50(當(dāng)50%DPPH自由基被清除時(shí)的試樣濃度)的結(jié)果見(jiàn)表2。茶多酚、維生素C、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚純化產(chǎn)物的IC50分別為2.75 mg/L、4.03 mg/L、3.57 mg/L和3.02 mg/L，結(jié)果表明黃連木葉多酚具有比較強(qiáng)的抗氧化能力。

表2 維生素 C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚IC50和 FRAP10

2.6 FRAP法測(cè)定黃連木葉多酚純化產(chǎn)物抗氧能力

圖2 FRAP法測(cè)定維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚的FRAP值Fig 2 FRAP values of vitamin C, tea polyphenols，crude polyphenols and polyphenols of P. chinensis leaf

由圖2可知，用FRAP法測(cè)定的黃連木葉多酚抗氧活性具有明顯的劑量效應(yīng)，純化多酚強(qiáng)于粗多酚和維生素C，但稍弱于純茶多酚。FRAP10(表10 μg/mL樣品濃度下FeSO4當(dāng)量)結(jié)果見(jiàn)表2?？寡趸芰ε判蚪Y(jié)果為茶多酚0.22、黃連木葉多酚0.20、黃連木葉粗多酚0.17及維生素C 0.16 (mmolFeSO4/L當(dāng)量)。FRAP法和DPPH法測(cè)定黃連木葉多酚抗氧活性弱于茶多酚，而強(qiáng)于黃連木葉粗多酚和維生素C結(jié)論是一致的，但是這兩種方法測(cè)得這4種物質(zhì)的抗氧活性在強(qiáng)弱的順序上存在差異，可能與DPPH和Fe3+提供電子能力不同和這兩個(gè)物質(zhì)還原能力不一樣以及實(shí)驗(yàn)參數(shù)衡量的參考水準(zhǔn)不一樣有關(guān)。

2.7 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)存活率的影響

黃連木葉多酚對(duì)胡桃醌處理后秀麗隱桿線蟲(chóng)的存活率的影響見(jiàn)圖3。胡桃醌(Juglone) 能顯著升高線蟲(chóng)體內(nèi)ROS[17]，并導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。但是經(jīng)過(guò)黃連木葉多酚預(yù)處理后，線蟲(chóng)的存活率顯著提高，說(shuō)明黃連木葉多酚具有比較強(qiáng)的抗氧能力。ROS通常被認(rèn)為是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性。過(guò)量的·0和·OH氧化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過(guò)氧化、交聯(lián)、聚合成脂褐素(一種難以消除的惰性廢物)，導(dǎo)致脂褐素堆積在細(xì)胞內(nèi)毒害細(xì)胞。同時(shí)也對(duì)核酸進(jìn)行氧化和交聯(lián)，使發(fā)生斷裂、突變，從而嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)遺傳信息的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，阻止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和信息的傳遞，進(jìn)而引起細(xì)胞調(diào)亡和機(jī)體衰老死亡效應(yīng)[21]。而黃連木葉多酚能有效降低ROS損傷導(dǎo)致的線蟲(chóng)死亡率。

圖3 黃連木葉多酚對(duì)線蟲(chóng)存活率的影響

2.8 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物影響線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證黃連木多酚對(duì)線蟲(chóng)的保護(hù)作用與清除ROS直接相關(guān)。本文對(duì)黃連木葉多酚抑制線蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的ROS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。線蟲(chóng)經(jīng)過(guò)胡桃醌(Juglone)處理后產(chǎn)生高濃度ROS[22]，而不同濃度的黃連木多酚可以有效的抑制其體內(nèi)的ROS。因此，黃連木葉多酚具備開(kāi)發(fā)成為新的天然抗氧化劑，并應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)藥產(chǎn)品領(lǐng)域。

a—陽(yáng)性對(duì)照； b—50 μg/mL多酚預(yù)處理； c—100 μg/mL多酚預(yù)處理； d—200 μg/mL多酚預(yù)處理； e—抑制ROS統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖4黃連木葉多酚對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的抑制效應(yīng)

Fig 4 The ROS inhibitory effect of polyphenols fromP.chinensisleaf

3 結(jié)論

黃連木葉粗多酚經(jīng)過(guò)硅膠柱純化后，其多酚、單寧、黃酮含量分別為1.0125 g當(dāng)量沒(méi)食子酸每克樣品、0.8600 g當(dāng)量單寧酸每克樣品和0.1453 g當(dāng)量蘆丁每克樣品。與粗多酚相比多酚含量提高了20.54%，單寧含量提高了13.53%，黃酮含量提高了12.03%。因而硅膠柱色譜法對(duì)酚類是個(gè)很好的純化方法，而且通過(guò)體內(nèi)和體外抗氧化法測(cè)定表明隨著酚類含量的提高，抗氧化活性也顯著性提高。因而黃連木葉多酚具有抗氧化性，是很好的天然抗氧化劑，具有在食品、保健等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的前景。

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