萬婧相興偉江玲麗周向陽

（1.舟山出入境檢驗檢疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，舟山 316000）

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)在復合體重組表達應用中的研究進展

萬婧1相興偉2江玲麗1周向陽1

（1.舟山出入境檢驗檢疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，舟山 316000）

真核細胞大部分生命活動是通過復合體催化的。因此，系統(tǒng)了解這些復合體的生物學功能，將在健康和疾病方面具有重要意義。由于內源性復合體存在低豐度和異質性特點，因而直接提取復合體存在一定的困難。桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)可成功表達復合體，為研究復合體的結構和功能提供新的手段。綜述近年來利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)進行蛋白質復合體結構和功能研究的進展。

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng) 復合體 晶體結構 功能

異源表達系統(tǒng)目前已成為分子生物學實驗室的基礎研究工具，對蛋白質功能研究具有深遠影響。大腸桿菌表達系統(tǒng)是蛋白表達技術中發(fā)展最早、應用最廣泛的，現(xiàn)已成功開發(fā)了許多表達質粒和相應的宿主菌。目前，蛋白質數(shù)據庫中（http：//www. rcsb.org/）收錄的蛋白大多數(shù)是由大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的。隨著復合體結構和功能研究趨勢的日益增加，原核表達系統(tǒng)在大分子量蛋白亞基的表達、翻譯后修飾，以及多個蛋白亞基同時表達等方面存在缺陷。因此，有必要利用功能更強大的真核表達系統(tǒng)來表達蛋白質復合體，該系統(tǒng)能夠滿足結構研究所需數(shù)量和質量的復合體。

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)是將外源目的基因插入桿狀病毒載體中，轉染入昆蟲細胞中對單個蛋白或者蛋白復合體進行高量表達的真核表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)自問世以來應用廣泛，在過去幾年中成為了結構生物學研究的主流。進行復合體結構生物學研究需要考慮樣品的制備、實驗條件的優(yōu)化、蛋白復合體表達的成本以及所需的時間等。目前通過改造桿狀病毒基因組提高蛋白質復合體的表達、開發(fā)多基因組裝的新質粒、建立細胞培養(yǎng)、病毒傳代、病毒感染和重組蛋白生產的標準操作程序，使桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)成為結構生物學研究中易于使用的常規(guī)操作工具［1］。MultiBac是一種桿狀病毒表達系統(tǒng)，是在Bac-to-Bac的基礎上通過改造轉移載體和Bacmid，實現(xiàn)真核多蛋白復合體或者單個基因多拷貝在昆蟲細胞中表達的有力工具，由2個供體載體pFBDM和pUCDM和改造過的受體Bacmid組成。目前，已利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)成功表達多種蛋白質復合體并進行相關結構和功能研究。如釀酒酵母轉錄中介復合體的頭部模塊、酵母細胞分裂后期啟動復合體APC/C和人轉錄因子TFIID核心支架復合體等。本文將從這幾種復合體闡述桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)在結構生物學研究領域中的應用。

1 釀酒酵母轉錄中介復合體的頭部模塊

轉錄中介復合體是由多個在進化過程中高度保守的亞基組成的蛋白復合體。在基因轉錄過程中，轉錄中介復合體分別與基因特異的轉錄因子和RNA聚合酶II相互作用，是真核生物基因轉錄的中央控制器［2-4］。于釀酒酵母中首次發(fā)現(xiàn)轉錄中介復合體，其由21個亞基構成，分子量超過1 MD［5，6］。研究證明，轉錄中介復合體個別亞基的突變，可導致神經系統(tǒng)疾病和癌癥［7-14］。因此，闡明轉錄中介復合體的功能是一個重大的生物醫(yī)學科學研究課題。但由于轉錄中介復合體的大分子量、高復雜性和低豐度的特點阻礙了其生物化學和結構的研究。

單粒子電子顯微鏡首次呈現(xiàn)了轉錄中介復合體的結構，與RNA聚合酶II的結構不同，其是緊湊型的球狀結構。酵母中的轉錄中介復合體由頭部、中部和尾部3個模塊構成［15，16］。結構學、遺傳學和生物化學研究證明每個模塊由7-9個單獨的亞基構成（圖1-a）。轉錄中介復合體參與細胞內的多種細胞活動，每個模塊執(zhí)行各自相應的功能［17］。例如，頭部模塊的亞基與RNA聚合酶C端區(qū)域相互作用［18，19］，而中部和尾部模塊的亞基直接與轉錄調控因子發(fā)生相互作用［4，20-23］。因此，可通過分別研究各個模塊的功能，以期進一步闡明整個復合體的結構和功能，這種策略明顯降低了研究整個轉錄中介復合體結構和功能的復雜性。

1.1 在昆蟲細胞中生產轉錄中介復合體的頭部模塊

轉錄中介復合體的頭部模塊由7個亞基構成，分別為Med17、Med6和Med8，Med11、Med22、Med18和Med20，分子量為223 kD。起初采用桿狀病毒共同感染的方法，即將7種不同的重組病毒（每種編碼一種亞基）共同感染昆蟲細胞［24］。然而，這種方法的試驗流程和操作步驟是極其漫長的，而且使得7種重組病毒的滴度保持平行是非常困難的。此外，進行X-射線晶體學研究，需要在盡可能短的時間內生產大量的復合體。因此，利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)，在同一個桿狀病毒中同時表達轉錄中介復合體頭部模塊的亞基將會從根本上解決上述問題。MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)通過串聯(lián)重組技術極大方便了多個基因盒的快速串聯(lián)重組拼裝［1］。通過串聯(lián)重組將編碼轉錄中介復合體頭部模塊亞基的所有基因組合到單個桿狀病毒結構中（圖1-b）［25，26］，顯著降低了試驗的復雜性。將多基因結構整合到MultiBac桿狀病毒的基因組中，能有效的減少蛋白質的水解并延長宿主細胞的裂解，有助于提高重組蛋白復合體的質量［1］。最后將重組病毒感染昆蟲細胞，在細胞中表達轉錄中介復合體的頭部模塊（圖1-b）。

1.2 重組轉錄中介復合體頭部模塊的結構

重組復合體生產的簡化推動了頭部模塊晶體結構的測定，消除MED17 和MED18的柔韌區(qū)可獲得良好有序的單晶結構，這有利于衍射數(shù)據的收集（圖1-c）。此外，在重組產生的蛋白樣品中加入硒基-L-甲硫氨酸有助于結構的測定。轉錄中介復合體頭部模塊晶體結構的測定，揭示了這一具有組件結合穩(wěn)定性以及轉錄調節(jié)靈活性的重要復合體是如何組建的，為其他轉錄因子結構的測定提供了一個平臺［26］。值得注意的是，頭部模塊中的5個亞基同時存在于一個緊湊的結構單元，將其命名為頸部區(qū)域。該區(qū)域通過形成一個新的多螺旋束，使得轉錄中介復合體具有穩(wěn)定性和完整性（圖1-c）。

2 后期促進復合體（APC/C）

APC/C是遍在蛋白連接酶復合體，由多個亞基構成，通過蛋白酶體依賴式水解細胞周期調節(jié)蛋白，調節(jié)細胞周期進程［27-29］。APC/C至少由13種不同的蛋白亞基構成，APC激發(fā)E2-遍在蛋白復合體同有絲分裂周期蛋白破壞框結合，然后激發(fā)遍在蛋白同破壞框C末端的賴氨酸殘基結合，此過程不斷循環(huán)使遍在蛋白多聚化。真核生物中APC/C是高度保守的，由于某些蛋白亞基具有兩個拷貝。因此，整個APC/C由18-19個亞基組成，分子量范圍在1-1.2 MD之間［30］。

2.1 利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產重組APC/C

APC/C大部分亞基分子量較大，遺傳操作性難度高，內源性豐度低，這些因素限制了APC/C的結構和生化研究。近年來發(fā)展的基于MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)，可以重組產生釀酒酵母以及人的APC/C，這極大地推動了APC/C的結構學、生化學和生理學的發(fā)展［30，31］。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)重組表達了釀酒酵母的APC/C，即通過構建兩種分別編碼5個亞基和8個亞基的重組病毒進行共表達。利用重組共表達系統(tǒng)生產的完整APC/C的產量是內源性的200多倍，達到0.5 mg/L。通過結構生物學比較分析釀酒酵母的內源性和重組APC/C，發(fā)現(xiàn)重組表達的復合體是正確組裝的（圖2-a 和圖2-b）。而且在激活劑存在的條件下，以一種D box和 KEN box依賴的方式實現(xiàn)有絲分裂細胞周期蛋白的泛素化［30］。利用重組的APC/C能夠重塑內源性APC/C的催化和調節(jié)功能，而且明確了釀酒酵母APC/C的分子組成，對全面系統(tǒng)的了解APC/C具有重要意義。

2.2 解析重組酵母的APC/C

重組表達整個和部分APC/C，得以精確測定APC/C的質量。質樸分析含有8個亞基的APC/C部分復體，測定的分子量為698.8 kD，與所有亞基的化學計量法所得的結果是一致的［30］。根據APC/C的結構圖重組產生了APC/C的部分復體，明確了三維APC/C中每個亞基的分子邊界。例如，Cdc16-Cdc26的差異密度密切對應Cdc16-Cdc26異源四聚體的晶體結構，通過差異密度可比較兩個APC/C部分復合體的差異（圖2-c）。通過亞基刪除策略，可以系統(tǒng)的調配APC/C的大部分亞基。通過整合APC/C單個亞基同源模型的晶體結構，利用冷凍電子顯微鏡在10 ?的分辨率下重塑APC/CCdh1.D-box三元復合體［32］，解析了高分辨率的APC/C亞基組成和原子模型［30，32］（圖2-d）。亞基刪除策略可精確界定APC/C亞基的分子邊界，相較于N端和C端標記粗略定位亞基的方法，該策略使得亞基原子模型的對接更準確可靠。

2.3 利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達人的整個APC/C

近期，兩個研究團隊利用昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)表達和重構人的APC/C［31，33］。其中一個研究團隊利用MultiBac的pFBDM 和pUCDM載體構建了多基因表達載體［34］，并利用USER連接依賴式的克隆方法［35，36］將所有的14個基因插入兩個重組病毒［31］。而另一個研究團隊構建了14種重組病毒，每種重組病毒表達單個APC/C亞基，然后將所有的重組病毒共同感染昆蟲細胞進行生化研究［33］。通過此種方法，明確Apc15 和Apc16也為人APC/C的組分。在鑒定Apc16之前，嘗試構建完整組裝的人重組APC/C無法獲得成功［31］。這表明Apc16定位于TPR部分復合體中［37］，是人APC/C精確組裝所必需的。因此，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)可重構正確組裝的人APC/C，表明APC/C發(fā)揮功能所必需的所有亞基都得到了鑒定（圖2-e和圖2-f）。

2.4 有絲分裂期檢驗點復合體（MCC）的X-射線結構

染色體分離的過程由一種被稱為紡錘體檢驗點的系統(tǒng)控制，通過MCC抑制APC/C，以確保子細胞獲得正確數(shù)目的染色體［38］。MCC組分包括：APC/C 共激活劑 Cdc20以及檢驗點蛋白Mad2、Mad3（BubR1）、Bub3和激酶Bub1，Mph1（Mps1）和 Aurora B。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達釀酒酵母MCC，其晶體結構表明Cdc20，Mad2 和Mad3組裝成為三角形的異源三聚體（圖2-g）［39］。Mad3通過與Mad2 和Cdc20形成許多亞基內的相互作用協(xié)調整個復合體，其N端區(qū)域的螺旋-環(huán)-螺旋模體可同時結合Mad2和Cdc20。

3 人通用轉錄因子TFIID

RNA聚合酶II（Pol II）啟動轉錄需步進式組裝的前起始復合體，該復合體由Pol II、TBP及通用轉錄因子TFIIA、B、D、E、F和H構成［41-43］。其中TFIID是啟動子識別復合體，是前體復合體組裝的基石，作為共激活劑介導信號的傳遞。人的TFIID由14個蛋白亞基構成，由TATA-box結合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）和TBP協(xié)同因子（TBP-associated factors）在體內裝配為復合體，分子量約為1.6 MD。TFIID可識別和結合核心啟動子，指導其他通用轉錄因子參與組裝［43］。

目前，對TFIID的精細分子模型、在細胞中的組裝，與染色質和其他因子互作的機制還了解甚少。研究TFIID在轉錄中的作用，有助于進一步理解基因表達調控。利用透射電鏡解析人類和酵母TFIID的整體形狀，都為類似于分子鉗的非對稱三裂結構［43］。細胞中內源性TFIID的水平非常低且復合體分子量大，阻礙了研究人員在分子細節(jié)上破譯其結構和功能。

目前，關于TFIID內亞基拷貝數(shù)的共識是：TAFs的 子 集（TAF4、TAF5、TAF6、TAF9和TAF12）含有兩個拷貝，而TBP和剩余的TAFs含有一個拷貝［41］。由于人類和酵母TFIID復合體的進化保守性以及形狀的整體相似性，推測所有物種的該復合體的亞基組成是類似的。研究人員利用RNAi技術敲除體外培養(yǎng)的果蠅組織的TFIID特異亞結構［44］，發(fā)現(xiàn)TAF4，TAF5，TAF6，TAF9和TAF12組成一個穩(wěn)定的TFIID核心支架復合體，對維持復合體穩(wěn)定性起到關鍵性作用。TFIID核心支架復合體存在兩個對稱的拷貝，而剩余的TAFs和TBP作為外圍亞基，這暗示了TFIID在組裝過程中可能發(fā)生了一個對稱到非對稱的過渡。此外，利用冷凍電子顯微鏡研究酵母的TFIID，也觀察到相對較小的對稱結構［45］。這些結果表明，對稱TFIID核心支架復合體的存在對整個復合體的完整性和組裝是至關重要的。最近，研究人員通過單顆粒冷凍電子顯微鏡，發(fā)現(xiàn)TFIID轉錄因子有兩種不同的結構狀態(tài)并存（標準態(tài)和重排態(tài)）。這一結構轉換能夠起始轉錄，將DNA的遺傳學信息轉錄到RNA中以便進行蛋白合成，展示了轉錄因子組合調控基因表達水平從而增加多樣性的機制［46］。

利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)、冷凍電子顯微鏡、X-射線晶體學和同源模型分析方法，解析人類TFIID核心支架復合體由10個亞基組成，分別為兩個拷貝的TAF4、5、6、9和12［48］（圖3）。起初，通過單個桿狀病毒構建多基因表達盒，表達TFIID核心支架復合體［34］，與釀酒酵母轉錄中介復合體頭部模塊的研究方法是相似的［26］。然而，單個亞基的表達水平差異很大，導致整個重組復合體的產量明顯降低。相對于含有所有亞基的正常組裝的復合體的表達水平，單個亞基的表達水平是很高的。利用親和標簽標記低表達量的亞基，可提高TFIID核心支架復合體的產量。然而，電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)小標簽的存在干擾復合體的結構。

解決這一瓶頸的方法來自于研究如冠狀病毒等某些病毒時所采用的策略。當病毒復制時，可以表達長的開放式閱讀框而形成多聚蛋白，這些多聚蛋白經過高度特異性蛋白酶的加工成為單個功能性多肽。MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)就應用這一策略，將編碼煙草蝕紋病毒NIa蛋白酶的基因以及相應的識別和切割序列插入到長的開放式閱讀框的5'端［1，49］。為了便于觀察和定量多聚蛋白的表達，在ORF的3'端插入編碼綠色熒光蛋白的基因（圖3-a）。結果表明煙草蝕紋病毒NIa蛋白酶可有效、特異地加工多聚蛋白，而且通過綠色熒光的強度可以定量多聚蛋白的表達水平。通過這一策略獲得了極其豐富的、正確裝配的TFIID核心支架復合體（包含10個亞基），并利用電子顯微鏡和X射線晶體學數(shù)據進行高分辨率分析（圖3-b和圖3-c）。TFIID核心支架復合體的結構是對稱的，而TAF8和TAF10的結合破壞了TFIID核心支架復合體原有的對稱結構，通過吸收剩余的TAFS和TBP，使得整個TFIID復合體的結構是非對稱的［48］。

4 結語

研究人員首先利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)成功表達釀酒酵母轉錄中介復合體的頭部模塊，然后利用冷凍電子顯微鏡和X-射線晶體學成功解析釀酒酵母轉錄中介復合體頭部模塊的晶體結構：其由Med17、Med11、Med22、Med6、Med8、Med18和Med20組成，包括固定爪、活動爪和頸部3個區(qū)域，其中頸部區(qū)域形成一個新的多螺旋束［26］。按照同樣的思路，成功解析細胞分裂后期啟動復合體APC/C和人轉錄因子TFIID核心支架復合體的晶體結構。可見，MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)已成為復合體結構生物學研究中的強有力工具。

進行蛋白質晶體學研究需要大量高豐度的均一化樣品，才能得到高分辨率的晶體結構信息。電子顯微鏡、單粒子分析和質譜分析不需要高豐度蛋白樣品，但對樣品的均一化程度要求較高［47］。同樣，蛋白的功能研究和藥物應用同樣需要高度均一化的蛋白樣品。細胞大部分生命活動通過蛋白質復合體實現(xiàn)，而對復合體的結構和功能的詳盡研究主要依賴于重組表達。然而，內源性復合體存在低豐度和異質性特點，因而直接提取復合體存在一定的困難。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)可以明確界定復合體的亞基組成，增加蛋白樣品的產量和均一化。此外，加工和突變特定的亞基可明確其在復合體中的功能和精細定位，這對全面了解復合體的生物學功能至關重要。

利用桿狀病毒真核表達系統(tǒng)表達真核生物的復合體，能夠符合結構晶體學研究所需的質量和數(shù)量。近年來，真核表達技術獲得了長足發(fā)展，為其他關鍵復合體結構和功能的研究提供了新的思路，也為結構晶體學的進一步發(fā)展奠定了基礎。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances on the Baculovirus Expression Vector System for Protein Complex Production

Wan Jing1Xiang Xingwei2Jiang Lingli1Zhou Xiangyang1
（1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316000；2. Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316000）

Most essential functions of eukaryotic cells are catalyzed by complex built of many subunits. To well understand their biological function in the process of health and disease, it is imperative to study these complexes. The low abundance and heterogeneity of many essential complexes have limited their extraction from native source material. The baculovirus expression vector system（BEVS）, specifically tailored for multiprotein complex production, has been proven itself to be uniquely suited for overcoming this impeding bottleneck. Here we highlight recent major achievements in multiprotein complex structure research which were catalyzed by this versatile recombinant complex expression tool.

Baculovirus expression vector system Complex Crystal structure Function

2013-8-18

浙江省重大科技專項（2011C13027-1）

萬婧，女，碩士研究生，研究方向：微生物與食品安全；E-mail：wanjing9687@126.com

周向陽，男，高級工程師，研究方向：微生物與食品安全；E-mail：zxy@zs.ziq.gov.cn