胡偉蓮 戴德慧

（浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023）

沙根骨中碳酸鈣礦化微生物分離篩選及鑒定

胡偉蓮 戴德慧

（浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023）

沙根骨（自命名）是在寧夏中衛(wèi)地區(qū)發(fā)現(xiàn)的以碳酸鈣為主的膠結物質將周圍的沙子凝聚在一起形管狀物。對沙根骨中碳酸鈣礦化微生物進行了分離篩選，共分離到12株菌株，其中3#菌株有較強碳酸鈣礦化能力，在經1.0% CaCl2液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)的72 h后，能形成礦物沉淀并形成薄膜掛壁。沉淀物質經掃描電鏡（SEM）及X射線粉末衍射（XRD）分析，確定為方解石和球霞石混合晶型的碳酸鈣晶體。根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA對3#菌株進行了鑒定，初步認定了該菌為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp.s3，為進一步研究沙根骨的形成機理奠定了良好基礎。

沙根骨 生物礦化 微生物 類芽孢桿菌屬

生物礦化是指在生物體中細胞的參與下，無機元素從環(huán)境中選擇性地沉析在特定的有機質上而形成礦物的過程［1］。生物體的礦化過程十分復雜，至今遠未充分認識生物礦物的形成機理以及基質、細胞等對生物礦物的調控作用。大多數(shù)的研究只是在生物體外簡單的模擬體系中進行，并且對生物大分子協(xié)同調控作用的研究非常少［2-6］。因此需要在更接近生物體內環(huán)境的條件下，進一步研究基質中的生物礦化過程、細胞與礦物的相互作用，以闡明生物礦物的形成過程，為開發(fā)仿生材料提供理論基礎。但目前生物礦化研究的對象主要為一些多細胞動物（如軟體動物、甲殼動物、脊椎動物等），調控及礦化過程過于復雜［7，8］，在無機物礦化的機理研究中難以突破，而在微生物生物礦化方面的研究也只是集中在地質的演變、礦物形成、微生物浸礦等方面的研究［9，10］，對于微生物礦化的種群生態(tài)、微觀機理、微生物活體與無機物的相互作用機制、微生物活體誘導無機物礦化的機理等方面研究相對較少。筆者在寧夏回族自治區(qū)沙漠地區(qū)發(fā)現(xiàn)少許有沙子黏結的細長管狀物（命名為沙根骨），管內中空。在該地區(qū)距地表30-60 cm以下發(fā)現(xiàn)內部充填著的褐色物質的沙管（圖1），對沙管及沙管中褐色物進行了顯微觀察及初步研究，發(fā)現(xiàn)該沙管是由沙子通過由碳酸鈣為主要膠結物質集聚而成的（圖2）。微生物礦化作用形成沙根骨現(xiàn)象在國內外文獻均未見報道。對其形成的機制研究具有原創(chuàng)性。本研究對沙根骨中微生物進行了分離、篩選及鑒定，為今后進一步研究沙根骨礦化微生物及生物礦化形成的機制研究奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙根骨樣品來源 沙根骨：樣品采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)地區(qū)。在采樣過程中，首先用鏟子鏟去表面的沙子，找到沙根骨，小心采集不短于20 cm的沙根骨，4℃保存?zhèn)溆?，在運輸及保存過程中注意防止污染。

1.1.2 主要試劑和儀器 瓊脂糖：BBI；DNA Ladder Mix maker SM0337（100-10000，上海生工）；Bacterial DNA Kit：SK1201（上海生工）；其他試劑均為分析純。水平槽電泳儀：DYC P-31DN（六一儀器廠，北京）；凝膠成像儀：FR980（上海復日科技儀器有限公司，上海）；高速冷凍離心機：HC-2518R（BBI美國）；超凈工作臺：SW-CJ-2FD 型（蘇州凈化設備有限公司，蘇州）：光 學 顯 微 鏡：BA210（Motick中國）。熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡：SIRION（FEI公司 荷蘭）；X射線衍射儀 X'Pert PRO（PANalytical 荷蘭）。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 （1）細菌篩選分離培養(yǎng)基（%）：牛肉膏 0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉 0.3，采樣地沙子10，瓊脂 2，pH7.4-7.6。（2）真菌篩選培養(yǎng)基（%）：硝酸鈉0.3，蔗糖 3，采樣地沙子 10，瓊脂 2，pH 自然。（3）放線菌篩選培養(yǎng)基（%）：可溶性淀粉2，KNO30.1，采樣地沙子10，瓊脂 2，pH7.4-7.6。（4）沙子培養(yǎng)基：采樣地沙子 20，瓊脂 2，pH自然。（5）液體礦化培養(yǎng)基：分別在牛肉膏蛋白胨細菌培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基，高氏一號液體培養(yǎng)基的基礎上添加1.0% CaCl2。121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 沙根骨中微生物的分離、純化 將新采集的沙根骨在無菌室中用無菌水沖洗去表面沙子及污物，以75%酒精進行表面消毒，用無菌水沖洗，將消毒后的沙根骨用無菌接種針將管內物推入到無菌生理鹽水中，并涂布到細菌、真菌、放線菌等分離培養(yǎng)基，分別至于26℃培養(yǎng)一定的時間，觀察生長情況。當出現(xiàn)單菌落后進一步劃線純化后斜面保藏。

1.2.2 碳酸鈣礦化微生物篩選 將斜面保存的各菌株斜面活化后，加入無菌水將菌體洗下制成菌懸液，按菌種類別分別接入裝有1.0 % CaCl2的發(fā)酵培養(yǎng)基中（300 mL三角瓶裝量50 mL）。置于26℃中180 r/min振蕩培養(yǎng)3-8 d，觀察發(fā)酵液中菌體生長、沉淀以及瓶壁掛膜等情況。

1.2.3 分析檢測 用濾紙抽濾去除發(fā)酵液和菌體細胞，所得沉淀用蒸餾水沖洗4-5次，洗去表面附著的發(fā)酵液，105℃干燥至恒重。對沉淀物質進行掃描電子顯微鏡及X射線衍射分析。

1.2.4 菌株鑒定 菌體形態(tài)觀察、生理生化反應及菌種全自動鑒定：選取碳酸鈣礦化能力最強的3#菌株，按參考文獻方法［11］觀察菌體形態(tài)并進行生理生化試驗。

16S rDNA 分子生物學法鑒定菌種：用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌種的基因組DNA，利用16S rDNA通用引物，上游引物為（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），下 游 引 物 為（5'-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3'）。進行PCR擴增。PCR擴增程序：98℃預變性3 min，98℃維持25 s，55℃維持25 s，72℃1 min，30個循環(huán)。PCR 產物檢測：預先制備質量分數(shù)為 1.0%的瓊脂糖凝膠，擴增反應完畢后，取 5 μL PCR 產物與上樣緩沖液混合，加樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳。DNA回收：從瓊脂糖中回收DNA，具體方法參照凝膠回收試劑盒說明書。測序：由生工上海生物工程有限公司代作測序。

系統(tǒng)進化樹構建：將目的菌株的16S rDNA基因序列輸入到GenBank基因數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank）中使用 Blast軟件進行序列同源性比較分析。選取同源性高的序列先通過Clustal W軟件進行程序進行多重對比后，利用MEGA 5.2軟件計算并構建系統(tǒng)進化樹［12，13］。

2 結果

2.1 沙根骨中菌株的分離與篩選

通過對沙根骨管腔內的褐色物質進行分離純化，共得到菌落形態(tài)或菌株形態(tài)有差異的菌株12株，其中細菌8株，均為革蘭氏陽性菌；放線菌2株，絲狀真菌2株。將分離純化得到12株菌株按菌種類別分別接入到篩選培養(yǎng)基中，根據(jù)菌株生長情況培養(yǎng)3-8 d。在發(fā)酵過程中，能使瓶壁掛上一層沉淀薄膜（圖3）和過濾后得到沉淀（圖4）的菌株有2株，分別為3#和6#菌株，其產生的沉淀分別為0.8 g/L和 0.07 g/L。由此可以初步判斷3#和6#均有一定的生物礦化能力，其中3#生物礦化能力最強，有可能是沙根骨中的晶體形成的主要微生物。對3#菌株的沉淀物質及種屬鑒定進行了進一步研究。

2.2 沉淀物質分析

為了定性分析所得沉淀物質，對樣品進行了X射線衍射和掃描電鏡觀察分析。

如圖 5所示，沉淀粉末樣品進行XRD分析。對照設備所帶數(shù)據(jù)庫及PDF 標準卡（PDF No：00-005-0586、No：00-033-0268）的有關數(shù)據(jù)，沉淀樣品出現(xiàn)方解石衍射峰，衍射角＝23.0o、29.4o、35.9o、39.5o、43.1o、47.5o、48.5o分別對應（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）、（116）晶面。此外還出現(xiàn)球霞石衍射峰，衍射角22θ＝21.0o、24.9o、27.0o、32.7o、42.7o、43.8o、49.0o、50.0o分別對應（004）、（110）、（112）、（114）、（008）、（300）、（304）、（118）晶面。說明沉淀樣品晶型是方解石和球霞石混合晶型。根據(jù)兩種晶型的衍射峰的強度經計算分析［14］，兩者的比例約為52∶48。

由圖6可以看出CaCO3顆粒呈分散狀態(tài)，形貌呈球形、方形和無規(guī)則塊狀體，分布雜亂無章，表面具有多層重疊結構特征，粒徑在0-15 μm，沉淀的樣品表面無明顯菌體印痕。可能菌體本身未參加CaCO3的生物礦化形成。

2.3 菌株鑒定結果

2.3.1 菌株的形態(tài)特征及生理生化特性鑒定 3#菌株形態(tài)特征見圖7。3#菌株在蛋白胨牛肉膏固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h 后即形成明顯的單菌落，菌落為無色透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑，粘稠。菌株革蘭氏染色為陽性，但隨培養(yǎng)時間增長菌體革蘭氏染色轉為紅色，兩端鈍圓，散生，運動，有較大莢膜，膨大胞囊內有接近頂端的橢圓形大芽孢。生理生化特征：接觸酶為陽性、氧化酶弱陽性、水解淀粉、脲酶陰性、VP陰性，不產硫化氫。

2.3.2 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 3#菌株16S rDNA經PCR擴增后得到約1 500 kb的DNA片段，回收純化后進行序列測定，序列總長為1 458 bp。將該序列在GenBank中提交（序列號KF669895）并進行同源性檢索，結果顯示在最相近的序列中，均為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）細菌。根據(jù)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST，從中選出14個具有代表性的菌株，根據(jù)其相近的菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.2構建系統(tǒng)進化樹，如圖8所示。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，3#菌株與Paenibacillus castaneae位于同一分枝，同源性最高，親緣關系最近。從分子生物學鑒定結果分析該菌株可以判定為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp. S3，但其種的確定還需通過模式菌進一步比對。

3 討論

方解石、文石及球霰石等3 種同質多象變體碳酸鈣是自然界分布最廣的礦物之一，微生物誘導碳酸鈣生物礦化一直是地質微生物學領域研究的重要內容［16-19］。礦化微生物通過其自身的新陳代謝，與周圍環(huán)境介質之間不斷發(fā)生酶化作用，形成膠結物質——方解石，經過長期的累積，可以將剛沉積的疏松碎屑物質最終膠結形成堅硬的巖石［20］。本研究所采取的樣品沙根骨即是微生物通過自身的代謝反應形成以碳酸鈣為主的膠結物質將周圍的沙子凝聚在一起形成沙管的形態(tài)，在惡劣的環(huán)境中對沙管中的微生物起保護作用。分離篩選得到碳酸鹽礦化微生物是研究沙根骨形成機制的前提條件。本研究通過對沙根骨中的微生物分離、純化及篩選得到一株碳酸鈣礦化微生物。在CaCl2培養(yǎng)基中能將Ca2+形成方解石、球霰石的混合晶型的碳酸鈣晶體，經形態(tài)、生理生化及分子生物學等方法確定了該菌株為類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）。為今后進一步研究沙根骨生物礦化機理方面的基礎研究提供材料。此外，若為該菌株提供適宜的環(huán)境條件，加速其酶化作用，快速沉積制備出 CaCO3，在較短時間內將石質材料膠結起來，可以為重大建筑工程、重要歷史建筑物裂縫以及石質歷史文物的修補提供新的方法和思路。

4 結論

從沙根骨中分離得到具有有較強碳酸鈣礦化能力的3#菌株，其礦化物經掃描電鏡（SEM）及X射線粉末衍射（XRD）分析，確定為方解石和球霞石混合晶型的碳酸鈣晶體。通過從形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA等方面的鑒定，初步確定了該菌為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp.s3.。

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（責任編輯 李楠）

The Isolation，Screening and Identification of CaCO3Mineralization Strain from Sand Boon

Hu Weilian Dai Dehui
（Department of Biology and Chemical Engineering，Zhejiang Universtity of Science and Technology，Hangzhou 310023）

Sand bone（named by the research team）is a tube that is agglutinated by sand with cementing material mainly composed of calcium carbonate. It was found in Zhongwei area of Ningxia Autonomous Region. Strain 3# has strong ability of CaCO3mineralization among 12 strains isolated from sand bone. Mineral deposit was produced and covered the flask wall after 72 h shake cultivation with 1.0% CaCl2liquid medium. To analyze the mineral deposits, XRD and SEM were performed. The result was showed that mineral deposit was made up of calcium carbonate, which contains two crystal forms（calcite and vaterite）. Based on morphological, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis, strain 3# was identified asPaenibacillussp., and was namedPaenibacillussp. s3 . It laid a good foundation for reaching formation mechanism of sand boon further.

Sand boon Biomineralization MicroorganismPaenibacillus

2013-09-03

浙江省自然科學基金資助項目（LY12C01004 ）

胡偉蓮，女，博士，副教授，研究方向：微生物生物技術；E-mail：weilian89@126.com