金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

利用不同啟動(dòng)子控制木糖代謝關(guān)鍵酶基因構(gòu)建可共代謝葡萄糖木糖重組釀酒酵母

金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子調(diào)控木糖代謝關(guān)鍵酶活性，構(gòu)建穩(wěn)定代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母。以本實(shí)驗(yàn)室專利菌株Saccharomyces cerevisiaeY5為宿主菌，將樹干畢赤酵母Pichia stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子（PGKp）控制下，釀酒酵母Y5內(nèi)源的木酮糖激酶基因XKS1分別由己糖激酶基因啟動(dòng)子（HXK2p）及其內(nèi)源啟動(dòng)子（XKS1p）控制。這3個(gè)基因連同各自表達(dá)元件導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，打通其木糖上游代謝途徑。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，HXK2p對(duì)木酮糖激酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的啟動(dòng)效率。重組菌Y5-X3-1中木糖還原酶/木糖醇脫氫酶/木酮糖激酶（XR/XDH/ XK）的酶活比值為1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的5倍，最高乙醇產(chǎn)量為24.35 g/L，達(dá)到理論值的73%。結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)XYL1、XYL2及XKS1啟動(dòng)子的強(qiáng)度，調(diào)控其表達(dá)水平，進(jìn)而改變3種酶的活性水平，對(duì)于提高重組釀酒酵母利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇有明顯效果。

重組釀酒酵母 木糖 乙醇 共發(fā)酵 啟動(dòng)子

以各類農(nóng)林廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇，具有廣闊的應(yīng)用前景。木質(zhì)纖維素類原料中半纖維素組分的有效利用可以使乙醇燃料的生產(chǎn)成本降低25%，這主要?dú)w功于其中的木糖。木糖是自然界中含量?jī)H次于葡萄糖的糖分，木糖的有效利用提高了植物原料生產(chǎn)乙醇的經(jīng)濟(jì)效益，因而對(duì)木糖生物轉(zhuǎn)化的研究是充分開發(fā)利用半纖維素的基礎(chǔ)［1］。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工業(yè)上生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌株，具有許多優(yōu)秀的生產(chǎn)性能［2］。但釀酒酵母不能有效地利用木質(zhì)纖維素中含量次豐富的木糖［3］。國(guó)內(nèi)外廣泛采用能天然代謝木糖產(chǎn)乙醇的樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）作為木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）的基因來源，構(gòu)建出可以代謝木糖的重組釀酒酵母，但是這些重組菌株發(fā)酵木糖能力較弱［4-6］。木酮糖激酶（Xylulokinase，XK）在釀酒酵母體內(nèi)負(fù)責(zé)催化木酮糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖，處于木糖代謝物進(jìn)入PPP途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，是促進(jìn)木糖代謝向下游進(jìn)行的關(guān)鍵酶。釀酒酵母本身具有該酶，但表達(dá)量小。研究表明，表達(dá)P.stipitis的XYL1、XYL2并同時(shí)超表達(dá)自身木酮糖激酶基因（XKS1），可以促進(jìn)菌株發(fā)酵木糖［7，8］。雖然表達(dá)XYL1、XYL2和XKS1的重組釀酒酵母可利用木糖發(fā)酵，但大多數(shù)的木糖都被用來產(chǎn)生木糖醇，乙醇發(fā)酵效果并不十分理想［9，10］，無法滿足工業(yè)化應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)外構(gòu)建的重組釀酒酵母無法滿足工業(yè)化應(yīng)用的主要原因之一是XR和XDH的輔酶特異性不同，容易在代謝過程中由于輔酶因子不能及時(shí)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致氧化還原不平衡造成副產(chǎn)物的積累，從而影響乙醇的轉(zhuǎn)化效率。Eliasson［11］建立在動(dòng)力學(xué)模型基礎(chǔ)上的數(shù)據(jù)模擬顯示，當(dāng)XR/XDH/XK值為1∶（≧10）∶（≧4）時(shí)，木糖醇的積累最少，乙醇產(chǎn)量最多。因此通過改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度，調(diào)節(jié)木糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，可達(dá)到增加乙醇產(chǎn)率，減少木糖醇積累的目的。Matsushika［12］建立了一系列含有由PGKp和ADHp啟動(dòng)子控制XYL1、XYL2和XKS1的整合質(zhì)粒的重組工業(yè)釀酒酵母。將這3個(gè)基因均置于PGKp啟動(dòng)子下的MR-4重組菌的XR/XDH/ XK值最接近理想比值，為1∶9∶6，其最高乙醇濃度達(dá)到15.6 g/L，乙醇得率則達(dá)到0.34 g/g，木糖醇產(chǎn)率下降到0.04 g/g。這表明通過調(diào)整啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度調(diào)控這3個(gè)基因的表達(dá)水平具有重要的實(shí)踐意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期已在工業(yè)菌株S. cerevisiaeY5中成功表達(dá)了來自休哈塔假絲酵母的木糖還原酶（XR）基因，來自熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶（XDH）基因和來自Y5的木酮糖激酶（XK）基因，并建立了一套適用于Y5的轉(zhuǎn)化體系。重組釀酒酵母在以3%葡萄糖和2%木糖為底物進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)可在12 h內(nèi)將葡萄糖消耗殆盡，但木糖利用率較低，最大乙醇產(chǎn)量11.01 g/L、木糖醇產(chǎn)量2.45 g/L［13］。

本研究將來自樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2，置于PGKp強(qiáng)啟動(dòng)子下，將來自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）和其內(nèi)源的木酮糖激酶啟動(dòng)子（XKS1p）下。擬將不同啟動(dòng)子控制下的基因XYL1、XYL2和XKS1導(dǎo)入到發(fā)酵性能良好的S.cerevisiaeY5中，以期能夠更加高效穩(wěn)定發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的重組酵母菌株的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）Top-10、畢赤酵母（Pichia stipitisCBS 6054）、釀酒酵母S.cerevisiaeY5（實(shí)驗(yàn)室專利菌種，專利號(hào)：ZL2008-10222897.7）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pDR195、PUC18以及YIp5-kanR也均由本實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pEASY-T1 Simple購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 大腸桿菌及轉(zhuǎn)化子用 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用時(shí)可補(bǔ)加100 μg/mL氨卞青霉素作為選擇培養(yǎng)基用于篩選轉(zhuǎn)化子，37℃靜止或搖瓶振蕩培養(yǎng)。酵母菌用YPD培養(yǎng)基，30℃靜止或搖瓶振蕩培養(yǎng)。

1.1.3 酶、抗生素及試劑 試驗(yàn)所用限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。分子生物學(xué)操作所用試劑盒、Taq DNA聚合酶為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。氨芐抗生素與生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，所用化學(xué)試劑為分析純。引物及基因序列的測(cè)定均由上海英駿（Invietrogen）生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 整合載體YIp5-XRXDH的構(gòu)建 分別以表達(dá)載體pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，PCR擴(kuò)增XYL1和XYL2連同PGKp啟動(dòng)子和ADH終止子的表達(dá)原件X1、X2。再將X1、X2依次連入酵母整合載體YIp5-kanR，構(gòu)建出重組酵母染色體整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH。

1.2.2 酵母表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X的構(gòu)建 以S. cerevisiaeY5基因組為模板，PCR擴(kuò)增HXK2p啟動(dòng)子、XKS1p啟動(dòng)子和木酮糖激酶基因XKS1。YIp5-KanR為模板擴(kuò)增篩選標(biāo)記KanR。將HXK2p啟動(dòng)子連同XKS1基因和ADH終止子的表達(dá)原件命名為X3-H；將XKS1p啟動(dòng)子連同XKS1基因和ADH終止子的表達(dá)原件命名為X3-X。將KanR、X3-H及X3-X連入PUC18載體中，分別獲得pXKS1-H和pXKS1-X表達(dá)載體。所需引物序列及酶切位點(diǎn)見表1。

1.2.3 重組菌株S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2的構(gòu)建 將整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH線性化后分別與表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X通過 LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化到S. cerevisiaeY5中，涂布于含G418的YPD培養(yǎng)基上，初步篩選轉(zhuǎn)化子。采取兩步篩選驗(yàn)證方法，首先隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，提取染色體基因組DNA，進(jìn)行X1及X2片段的PCR擴(kuò)增，篩選出YIp5-XRXDH整合成功的陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)入第二步篩選；隨后提取陽性轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒，進(jìn)行X3片段的PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步篩選出pXKS1-H或pXKS1-X轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子，分別命名為S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2。

1.2.4 木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）酶活的測(cè)定 粗酶液的制備以及木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的酶活測(cè)定完全參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。用Coomassie Blue法［15］測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2代謝混合糖產(chǎn)乙醇發(fā)酵試驗(yàn) 將待發(fā)酵的宿主菌S. cerevisiaeY5和重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2分別接種于100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min活化24 h。然后換成新鮮的YEPD液體培養(yǎng)基，于同樣條件下增殖培養(yǎng)24 h，測(cè)定其細(xì)胞含量（OD600值）。將培養(yǎng)得到的菌液離心，收集沉淀，用0.9% NaCL溶液洗滌沉淀兩次，作為發(fā)酵種子液。

將S. cerevisiaeY5、S. cerevisiaeY5-X3-1，S. cerevisiaeY5-X3-2的種子液分別接種到50 mL 1.5%葡萄糖、5%木糖的混合糖培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為30℃，150 r/min。發(fā)酵起初每隔4 h取樣一次，12 h后每隔12 h取樣一次，取樣量為1 mL，連續(xù)取樣120 h。發(fā)酵樣品分析葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇濃度。

1.2.6 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分析方法 糖濃度測(cè)定：采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱Hi-plex H柱，柱溫40℃，檢測(cè)器為安捷倫示差檢測(cè)器，流動(dòng)相0.005 mol/L硫酸，流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。乙醇濃度測(cè)定：Agilent7890A氣相色譜儀，色譜柱HJ-PEG-200M為 60 m×0.32 mm×0.5 μm，柱溫為120℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 重組酵母整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH構(gòu)建

構(gòu)建流程如（圖1）所示，分別以pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在2 230 bp、2 250 bp處分別有明顯條帶（圖2）。亞克隆產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，X1和X2與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質(zhì)同源性均達(dá)100%，克隆得到的基因X1和X2序列正確。

分別用SphI、NheI雙酶切或EagI、SphI雙酶切亞克隆產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化獲得X1、X2基因。將X1連接在YIp5-kanR的SphI與NheI位點(diǎn)，將X2連接在YIp5-kanR的EagI與SphI位點(diǎn)，構(gòu)建出重組酵母染色體整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH。質(zhì)粒單、雙酶切驗(yàn)證結(jié)果正確（圖3）。

2.2 酵母表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X的構(gòu)建

構(gòu)建流程如圖1所示，以釀酒酵母Y5為模板擴(kuò)增HXK2p、XKS1p和XKS1基因。以YIp5-kanR為模板擴(kuò)增kanR篩選標(biāo)記。分別用EcoR I、BamH I和SalI、NdeI雙酶切pXKS1-H和pXKS1-X，分別切下2 540 bp/4 501 bp、1 702 bp/5 339 bp和2 706 bp/4513、1 702 bp/5 517 bp，質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖4）。

2.3 工業(yè)釀酒酵母S. cerevisiae Y5轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子染色體基因組DNA及其質(zhì)粒，結(jié)果顯示，S. cerevisiaeY5-X3-1在2230 bp、2250 bp和2920 bp處分別有一個(gè)明顯條帶（圖5-A）；同時(shí)提取S. cerevisiaeY5-X3-2的染色體基因組DNA及質(zhì)粒pXKS1-X，PCR驗(yàn)證（圖5-B）顯示，S. cerevisiaeY5-X3-2在2230 bp、2250 bp和3086 bp處分別有一個(gè)明顯條帶。兩株重組菌株均擴(kuò)增得到大片段X1、X2、X3。亞克隆產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，X1、X2和X3與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質(zhì)同源性均達(dá)100%，克隆得到的基因X1、X2和X3序列正確。表明外源目的基因成功導(dǎo)入到酵母中。

2.4 重組釀酒酵母木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶酶活測(cè)定

分別測(cè)定宿主菌S. cerevisiaeY5及轉(zhuǎn)化子S. cerevisieY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2粗酶液中木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）的比活力水平，結(jié)果（表2）顯示宿主菌株S. cerevi-siaeY5中基本沒有木糖還原酶和木糖醇脫氫酶酶活，木酮糖激酶的酶活水平極低。轉(zhuǎn)化子S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的比活力分別為宿主菌株的160倍和78倍。說明來源于P. stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2在宿主菌株S. cerevisiaeY5中得到了活性表達(dá)。此外，在Y5-X3-1菌株中，HXK2啟動(dòng)子控制下的XK顯示出相應(yīng)較高的酶活水平。

2.5 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

宿主菌和重組菌株的生長(zhǎng)曲線（圖6）顯示在混合糖培養(yǎng)基中宿主菌S. cerevisiaeY5及重組菌的生長(zhǎng)情況。宿主菌生長(zhǎng)緩慢，在120 h測(cè)得其最大生長(zhǎng)量。兩株重組菌生長(zhǎng)狀況相似，且均明顯優(yōu)于宿主菌，說明異源基因XYL1和XYL2的插入未影響重組菌的生長(zhǎng)。另外，S. cerevisiaeY5-X3-1的生長(zhǎng)狀況略優(yōu)于S. cerevisiaeY5-X3-2。

2.6 代謝葡萄糖和木糖限氧共發(fā)酵試驗(yàn)

重組酵母菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2 陽性轉(zhuǎn)化子及宿主菌S. cerevisiaeY5在限氧條件下進(jìn)行葡萄糖木糖共發(fā)酵搖瓶試驗(yàn)。HPLC檢測(cè)分析發(fā)酵底物的消耗和產(chǎn)物的生成（圖7）。

重組菌在4 h內(nèi)將葡萄糖消耗殆盡后開始利用木糖，且均在120 h內(nèi)基本將木糖代謝完畢。將木酮糖激酶基因XKS1置于已糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）的重組菌Y5-X3-1在96 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量24.37 g/L（圖7-B），而將此基因置于其內(nèi)源啟動(dòng)子（XKS1p）的重組菌Y5-X3-2在96 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量為21.47 g/L（圖7-C）。兩株重組菌的乙醇產(chǎn)率分別達(dá)到理論值的76%和67%。宿主菌Y5在混合糖發(fā)酵初級(jí)階段8 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量7.40g/L，同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)其葡萄糖消耗完畢，故推斷宿主菌Y5所產(chǎn)乙醇應(yīng)全為葡萄糖發(fā)酵生成。由圖（7-A）可以看出，宿主菌也能利用少量的木糖，并且產(chǎn)生約9.02 g/L木糖醇，一般認(rèn)為在非特異性還原酶的作用下，釀酒酵母可以消耗少量的木糖。Y5-X3-1和Y5-X3-2的木糖消耗均為宿主菌的5倍，乙醇產(chǎn)量分別是宿主菌的3.3倍和2.9倍。由此說明，木糖代謝關(guān)鍵酶基因成功導(dǎo)入釀酒酵母Y5中，并得以成功表達(dá)，其木糖代謝上游途徑已打通。

兩株重組菌經(jīng)120 h發(fā)酵，Y5-X3-1在乙醇得率方面較Y5-X3-2增加了16.1%，前者木糖醇最高濃度為10.47 g/L，后者為11.87 g/L，相比下降了13.3%（表3）。

3 討論

國(guó)內(nèi)外構(gòu)建能利用木糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母普遍采用將天然利用木糖真菌中的XYL1與XYL2基因轉(zhuǎn)入S. cerevisiae，重組菌株雖能利用木糖，但中間產(chǎn)物木糖醇大量積累，乙醇產(chǎn)量不高。分析原因主要是重組釀酒酵母中表達(dá)的XR和XDH所需的輔因子不平衡［16，17］。利用不同啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)可以進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，使目的基因適度表達(dá)，減少由于過量表達(dá)引起的細(xì)胞內(nèi)部負(fù)擔(dān)。

用于大規(guī)模乙醇生產(chǎn)的菌株多為耐受乙醇和木質(zhì)纖維素水解液中抑制物能力較強(qiáng)，染色體組為多倍體的工業(yè)釀酒酵母菌株［18-21］。二倍體絮凝菌株S. cerevisiaeY5能夠耐受發(fā)酵過程中產(chǎn)生的較高濃度的抑制劑，具有良好的乙醇發(fā)酵性能［22，23］。本研究以S. cerevisiaeY5為宿主菌，在引入木糖代謝關(guān)鍵酶的同時(shí)過表達(dá)木酮糖激酶基因，并通過啟動(dòng)子的不同調(diào)節(jié)3個(gè)酶的酶活比例。

由于己糖激酶基因啟動(dòng)子（HXK2p）轉(zhuǎn)錄水平較XKS1基因自身啟動(dòng)子（XKS1p）較強(qiáng)［18］，因此兩株重組菌酶活顯示Y5-X3-1的木酮糖激酶酶活水平高于Y5-X3-2。對(duì)比兩株重組菌，木酮糖激酶酶活較高的Y5-X3-1在混合糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力不及Y5-X3-2。Jin 等［19］認(rèn)為表達(dá)過高水平的木酮糖激酶可能會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的ATP 水平從而影響菌體的生長(zhǎng)。

重組菌Y5-X3-1和Y5-X3-2的XR/XDH/XK比值分別約為1∶5∶4和1∶5∶2。其他相關(guān)研究結(jié)果表明，當(dāng)重組菌的XR/XDH/XK比值為1∶（≧10）∶（≧4）時(shí)，木糖醇積累最少，乙醇產(chǎn)量最多［11］。Y5-X3-1的XR/XDH/XK比值與理論值最相近，乙醇產(chǎn)量最高。

4 結(jié)論

本文將來自樹干畢赤酵母（P.stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于PGKp強(qiáng)啟動(dòng)子下,同時(shí)將來自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）和其內(nèi)源的木酮糖激酶啟動(dòng)子（XKS1p）下。通過啟動(dòng)子的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)XR/XDH/XK三者比值達(dá)到1∶5∶4，接近1∶（≧10）∶（≧4）的最優(yōu)比例，從而降低了副產(chǎn)物木糖醇的積累，提高了乙醇的產(chǎn)率，初步實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建更為高效穩(wěn)定共代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇重組釀酒菌株的目標(biāo)。

［1］ 曹秀華, 阮奇城, 林海紅, 等. 纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué), 2010, 32（3）：166-182.

［2］ 謝麗萍, 王正祥, 諸葛健. 利用可再生資源生產(chǎn)酒精的細(xì)菌、酵母中的代謝工程［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 127（112）：63-68.

［3］ Jeffries TW, Jin YS. Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 63（5）：495-509.

［4］ Guo T, Liang DF, Bao XM. Establishment and ethanol fermentation of a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae［J］. Sugarcane and Canesugar, 2007, 3：26-29.

［5］ Johansson B. Hahn-H?gerdal B. The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylulose but not of xylose in Saccharomyces cerevisiae TMB3001［J］. FEMS Yeast Research, 2002, 2（3）：277-282.

［6］ Wahlbom CF, Zyl WH, J?nsson LJ, et al. Generation of the improved recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae TMB 3400 by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis CBS 6054［J］. FEMS Yeast Res, 2003, 3（3）：319-326.

［7］ Johansson B, Christensson C, Hobley T, et al. Xylulokinase overexpression in two strains of Saccharomyces cerevisiae also expressing xylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermentation of xylose and lignocellulosic hydrolysate［J］. Appl Environ Microbiol, 2001, 67（9）：4249-4255.

［8］ Wang Y, Shi WL, Liu XY, et al. Establishment of a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae［J］. Biotechnology Letters, 2004, 26（11）：885-890.

［9］ Lee SH. Kodaki T, Park YC, et al. Effects of NADH-preferring xylose reductase expression on ethanol production from xylose in xylosemetabolizing recombinant Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Biotechnology, 2012, 158（4）：184-191.

［10］ Katahira S, Mizuike A, Fukuda H, et al. Ethanol fermentation from lignocellulosic hydrolysate by a recombinant xylose- and cellooligosaccharide-assimilating yeast strain［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72（6）：1136-1143.

［11］ Eliasson A, Hofmeyr J-HS, Pedler S, et al. The xylose reductase/ xylitol dehydrogenase/xylulokinase ratio affects product formation in recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae［J］. Enzyme Microbial Technology, 2001, 29（4/5）：288-297.

［12］ Matsushika A, Sawayama S. Comparative study on a series of recombinant flocculent Saccharomyces cerevisiae strains with different expression levels of xylose reductase and xylulokinase［J］. Enzyme Microbi Technol, 2011, 48：466-471.

［13］ 張潔寧, 田沈, 楊秀山. 提高木糖代謝能力的釀酒酵母Y5-X3的初步構(gòu)建［J］ . 可再生能源, 2012, 30（4）：47-51.

［14］ Matsushika A, Watanabe S, Kodaki T, et al. Expression of protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase increases ethanol production from xylose in recombinantSaccharomyces cerevisiae［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81（2）：243-255.

［15］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Analy Biochem, 1976, 72（1/2）：248-254.

［16］ Steinmetz EJ, Warren CL, Kuehner JN, et al. Genome-wide distribution of yeast RNA polymerase II and its control by Sen1 helicase［J］. Molecular Cell, 2006, 24（5）：735-746.

［17］ Watanabe S, Salen AA, Pack SP, et al. Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase［J］. Journal of Biotechnology, 2007, 130（3）：316-319.

［18］ Peng BY, Shen Y, Li XW, et al. Improvement of xylose fermentation in respiratory-deficien xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae［J］. Metabolic Engineering, 2012, 14 （1）：9-18.

［19］ Xiong MY, Chen GH, Barford J, et al. Alteration of xylose reductase coenzyme preference to improve ethanol production by Saccharomyces cerevisiae from high xylose concentrations［J］. Bioresource Technology, 2011, 102 （19）：9206-9215.

［20］ Jin YS, Ni HY, Laplaza JM, et al. Optimal growth and ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae require moderate D-xylulokinase activity［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69（1）：495-503.

［21］ Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, et al. Purification and properties of the NAD+-xylitol-dehydrogenase from the yeastPichia stipitis［J］. Joural of Fermentatin Bioengineering, 1989, 67（1）：20-24.

［22］ Tian S, Zhu JY, Yang XS. Evaluation of an adapted inhibitortolerant yeast strain for ethanol production from combined hydrolysate of softwood［J］. Applied Energy, 2011, 88（5）：1792-1796.

［23］ Tian S, Yang XS, Zhu JY. Robust cellulosic ethanol production from SPORL-pretreated lodgepole pine using an adapted strain Saccharomyces cerevisiae without detoxification［J］. Bioresource Technology, 2010, 101（22）：8678-8685.

（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Strains Through Expressing the Key Genes in the Xylose Metabolism Under the Control of Different Promoters for Co-fermentation Glucose and Xylose

Jin Yi Wang Zhen Mo Chunling Yang XiuShan Tian Shen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）

In order to obtain a recombinant yeast strain which can co-ferment both xylose and glucose, the key genes of enzymes in the xylose metabolism were cloned and transformed intoSaccharomyces. cerevisiaeY5. TheXYL1andXYL2genes fromPichia stipitisCBS6054 were placed under thePGKp, which is a constitutive strong promoter；endogenesisXKS1gene fromS.cerevisiaeY5 was controlled byHXK2pand the native promoterXKS1p, respectively. We measured the activity of XR、XDH and XK and evaluated the xylose-fermenting abilities of the engineered strains. The highest xylulokinase activity was observed in the strain Y5-X3-1 whoseXKS1was controlled byHXK2p. The activity of enzyme ratio was 1∶5∶4 between XR, XDH and XK. Furthermore, the xylose consumption ofS.cerevisiaeY5-X3-1 was 5 times as the host strain during co-fermentation, and the highest ethanol concentration was 24.35 g/L, which correspond to 73% of the theoretical value.

Saccharomyces cerevisiaeXylose Ethanol Co-fermentation Promoter

2013-08-28

北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201310028034），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100578）

金怡，女，碩士研究生，研究方向：微生物酶和發(fā)酵工程；E-mail：jinyikele@163.com

田沈，博士，教授，研究方向：微生物與生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化；E-mail：cnu_tianshen@sina.com