萬(wàn) 健，吳三橋，趙冠杰，陳 琛

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs) 是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵害的作用，是生物天然免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定好、水溶性好、強(qiáng)堿性、廣譜抗菌和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)[1-4]。20世紀(jì)80年代瑞典科學(xué)家HG.Boman等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離出第一個(gè)抗菌肽—天蠶素(cecropin)[5]。此后，人們相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動(dòng)物乃至人類中發(fā)現(xiàn)了2000多種抗菌肽?？咕目梢愿鶕?jù)以上來(lái)源分類，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)將其分為5種：(1)α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽，如Cecropin A、Magainin；(2)β-折疊肽，如Tachyplesins；(3)富含半胱氨酸的抗菌肽，如HNP-1，-2和-3；(4) 富含特殊氨基酸的抗菌肽，該類型抗菌肽通常帶有一個(gè)或多個(gè)占主導(dǎo)地位的氨基酸， 如從牛的嗜中性細(xì)胞里分離出來(lái)的Indolicidin 由13個(gè)氨基酸殘基組成， 其中就含有5個(gè)色氨酸；(5)含稀有被修飾氨基酸的抗菌肽。人抗菌肽分為三類：防御素(defensins)、cathelicidins和富組蛋白(histatins)。

防御素是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類具有抵抗外界微生物侵襲的堿性陽(yáng)離子抗菌肽。人防御素根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)及所含3對(duì)二硫鍵連接方式的不同可分為α-防御素(human α-defensin, or human defensin neutrophil peptide,HNP )和β-防御素。α-防御素的3對(duì)二硫鍵以1-6，2-4，3-5的方式連接，β-防御素的3對(duì)二硫鍵以1-5，2-4，3-6的方式連接(如表1)，它們具有相似的3條反向平行β-片層結(jié)構(gòu)。Bensch等[6]于1995年首次從腎功能衰竭病人的血液透析液中分離出HBD-1并獲得其氨基酸序列，隨后其他5個(gè) HBD被相繼發(fā)現(xiàn)，目前人β-防御素家族有6個(gè)主要成員，HBD-1～6。β-防御素主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，是機(jī)體抵御外界微生物侵害和參與免疫應(yīng)答的重要成員，具有極強(qiáng)的抗菌[7]、抗病毒[8-9]、抗腫瘤活性[10]以及免疫學(xué)活性[11-13]。本文對(duì)HBD的結(jié)構(gòu)、表達(dá)部位，原核、真核表達(dá)的系統(tǒng)，表達(dá)技術(shù)和方法進(jìn)行了綜述，以期對(duì)人β-防御素及其他抗菌肽的基因工程重組表達(dá)提供思路。

1 HBD的結(jié)構(gòu)及表達(dá)部位

HBD基因定位于人染色體8p22～p23.1區(qū)小于1M的范圍內(nèi)，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，HBD家族的六個(gè)主要成員均位于該區(qū)域內(nèi)。HBD前體由93～95個(gè)氨基酸組成，包括信號(hào)肽、原片段和成熟肽3部分。在整個(gè)氨基酸序列中有2種高度保留的氨基酸，一種是位于N端的甘氨酸(2個(gè))，另一種是半胱氨酸(6個(gè))，保守的6個(gè)半胱氨酸殘基配對(duì)形成3對(duì)二硫鍵，起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵和β-片層結(jié)構(gòu)可以使小分子防御素緊密連結(jié)以抵抗蛋白酶水解，即使在富含蛋白的吞噬溶酶體環(huán)境中仍能保持其活性，這也是防御素不同于其他抗微生物肽的主要原因。

HBD-1由36個(gè)氨基酸組成，約7.0 kb，其第一個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽和原片段，第二個(gè)外顯子編碼成熟肽，在上皮細(xì)胞中是生理性表達(dá)。HBD-2由41個(gè)氨基酸組成，其中第一個(gè)外顯子編碼5′端非翻譯區(qū)信號(hào)肽區(qū)和前導(dǎo)肽區(qū)，第二個(gè)外顯子編碼部分前導(dǎo)肽成熟肽和3′端非翻譯區(qū)，HBD-2的各種生物活性都是由成熟肽來(lái)執(zhí)行完成。HBD-2主要表達(dá)在受感染刺激后的皮膚和黏膜組織中，是一種誘導(dǎo)型防御素，在感染、炎癥等狀態(tài)下表達(dá)明顯增強(qiáng)[14]，且研究人員發(fā)現(xiàn)NF-kB與這種誘導(dǎo)表達(dá)密切相關(guān)[15-16]。HBD-3主要表達(dá)于皮膚、口腔粘膜和扁桃體中，在呼吸道、生殖道上皮細(xì)胞和胎盤中亦有表達(dá)，可被TNF-a、IL-1β-、TGF、γ-干擾素等誘導(dǎo)表達(dá)。與HBD-1表達(dá)方式不同，HBD-2和HBD-3主要為誘導(dǎo)型表達(dá)。HBD-4在睪丸中高表達(dá)，在胃竇中也有較高表達(dá)，而在甲狀腺、肺、腎、子官和中性粒細(xì)胞中微表達(dá)。HBD-5和HBD-6僅在附睪細(xì)胞中有所表達(dá)。

表1 人β-防御素氨基酸序列、分子結(jié)構(gòu)

2 HBD的基因工程重組及表達(dá)

由于抗生素的長(zhǎng)期廣泛使用，使得許多細(xì)菌都產(chǎn)生了耐藥性，比較突出的有2010年新德里“超級(jí)細(xì)菌”事件[17]。與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，人β-防御素?zé)岱€(wěn)定性好，高效廣譜抗菌，具有極強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫學(xué)活性[18]，病原菌對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性。HBD的這些優(yōu)點(diǎn)決定其在醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)、食品工業(yè)等方面將發(fā)揮極為重要的作用。怎樣大量獲得HBD就成了首要問(wèn)題，目前獲取的主要途徑有3條：從細(xì)胞或體液中提取、化學(xué)合成、基因工程表達(dá)。HBD在組織中的表達(dá)量極少，純化工藝的難度與成本也較高，化學(xué)合成價(jià)格昂貴，且體內(nèi)蛋白質(zhì)往往需要翻譯后的修飾才具有活性。因此，通過(guò)基因工程手段大量生產(chǎn)HBD成為一條非常有效的途徑。

2.1HBD的原核表達(dá) 在各種表達(dá)系統(tǒng)中，原核表達(dá)系統(tǒng)是最早采用的，也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、安全性好、可高表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，是目前HBD表達(dá)采用最多的表達(dá)系統(tǒng)。

由于人β-防御素是一類陽(yáng)離子小分子多肽，表達(dá)過(guò)程中極易在蛋白酶的作用下降解，而且對(duì)宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，易造成宿主細(xì)胞的死亡。通常HBD基因在大腸桿菌中采用融合型表達(dá)，即目的蛋白HBD與一段融合標(biāo)簽序列如組氨酸標(biāo)簽蛋白(His-Tag)、硫氧化還原蛋白 (Thioredoxin, Trx)、類彈性蛋白(Elastin-like peptide, ELP)、小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-related modifier, SUMO)等融合表達(dá)，這些融合標(biāo)簽可增加HBD mRNA的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的蛋白分離、純化、檢測(cè)等提供便利，同時(shí)也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性，其作用類似于天然抗菌肽產(chǎn)生過(guò)程中能夠保護(hù)抗菌肽及宿主菌的前導(dǎo)肽部分[19]。HBD在大腸桿菌中的表達(dá)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量的研究，具體見(jiàn)表2。

表2 人β-防御素在大腸桿菌中的表達(dá)

注：DHFR=運(yùn)載蛋白 Intein=內(nèi)含肽 ND= Not Determined

自Harder等[20]在原核細(xì)胞中采用了融合表達(dá)的方式，首次實(shí)現(xiàn)了HBD-3的體外表達(dá)以來(lái)，隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入研究，及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，原核表達(dá)系統(tǒng)在功能上得到了進(jìn)一步的改善，HBD的原核表達(dá)經(jīng)歷了一個(gè)從無(wú)到有，表達(dá)量由低到高，抗菌活性由弱到強(qiáng)，純化過(guò)程由復(fù)雜到簡(jiǎn)便的歷程。

雖然HBD在大腸桿菌中表達(dá)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但大腸桿菌表達(dá)體系與其他體系相比也有一些缺點(diǎn)：高效表達(dá)但易形成包涵體，不能進(jìn)行翻譯后的加工修飾，如糖基化、磷酸化、?；约岸蜴I的形成等，而且E.coli表達(dá)的蛋白還會(huì)保留它們氨基末端的甲硫氨酸，這會(huì)影響到目的蛋白的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生免疫原性。最近有研究發(fā)現(xiàn)共表達(dá)折疊酶或者分子伴侶在一定程度上能克服包涵體的形成，分子伴侶本身不是功能蛋白的組成部分，但是能夠阻止分子間和分子內(nèi)不正確的折疊，進(jìn)而幫助蛋白質(zhì)折疊成正確的構(gòu)象。Li等[25]利用小分子泛素蛋白(SUMO)融合表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達(dá)HBD4-SUMO融合蛋白，可以促進(jìn)HBD4的正確折疊，增加表達(dá)量，而且融合蛋白經(jīng)過(guò)SUMO酶酶切去除SUMO標(biāo)簽后，N端沒(méi)有殘留氨基酸，得到純度較高的目的蛋白。

最近幾年，研究人員重點(diǎn)研究將目的蛋白與一些具有活性的小蛋白融合，進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白在E.coil中的表達(dá)[27]，或者通過(guò)改造現(xiàn)有的表達(dá)載體，構(gòu)建各種促溶標(biāo)簽載體，進(jìn)而使在E.coli中以包涵體形式表達(dá)的蛋白以可溶性形式表達(dá)[28]。

2.2HBD的真核表達(dá) 真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)等。酵母是一類低等真核生物，它既有類似原核生物的生長(zhǎng)特性，又有一般真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，是目前HBD表達(dá)應(yīng)用最為普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。

2.2.1在酵母中表達(dá) 酵母表達(dá)系統(tǒng)中以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，具有操作簡(jiǎn)單、高水平分泌表達(dá)外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且甲醇能夠誘導(dǎo)畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)。AOX1是強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠高水平誘導(dǎo)表達(dá)外源基因。酵母帶有α分泌信號(hào)，可引導(dǎo)外源蛋白的分泌，減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷以及宿主細(xì)胞蛋白水解酶的降解作用。近年來(lái)研究者開(kāi)展了HBD在酵母中的表達(dá)，具體見(jiàn)表3。

表3 人β-防御素在酵母中的表達(dá)

雖然HBD在畢赤酵母中表達(dá)相對(duì)于在大腸桿菌表達(dá)起步比較晚，但畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有其他表達(dá)系統(tǒng)所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn): 如對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，易于高密度發(fā)酵，自身分泌的背景蛋白少，因酵母是真核生物，安全性高，提供翻譯后加工和分泌的環(huán)境，不會(huì)形成包涵體，易于進(jìn)行分離提純等，使得人β-防御素在畢赤酵母中表達(dá)的研究有很大的優(yōu)勢(shì)。

盡管如此，HBD在畢赤酵母中表達(dá)也存在著一些問(wèn)題，比如畢赤酵母的糖基化程度比哺乳動(dòng)物偏大，而且糖基化途徑與人不同，從而影響了HBD蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。過(guò)去的20多年里，有很多研究人員致力于畢赤酵母的N-糖基化改造過(guò)程中。王越等[34]成功構(gòu)建了敲除α-1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的巴斯德畢赤酵母，和野生型相比，大大降低了蛋白質(zhì)的糖基化程度，從而為酵母的糖基化工程提供了基礎(chǔ)。另外，信號(hào)肽加工不完全以及內(nèi)部降解等造成表達(dá)產(chǎn)物不均一，這在一定程度上限制了畢赤酵母的應(yīng)用。酵母表面展示技術(shù)，利用酵母細(xì)胞壁蛋白(α-凝集素)與外源蛋白相融合，融合蛋白表達(dá)分泌中由于其糖基化蛋白與細(xì)胞壁的共價(jià)結(jié)合作用，將外源蛋白錨定在細(xì)胞壁上[35]。提示，也許以后HBD的表達(dá)也能應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，這樣可以減少純化工藝，提高回收率。

2.2.2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) HBD在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)也有報(bào)道，彭巍等[36]將HBD-3 cDNA插入到真核表達(dá)載體pEGFP-C1 中，構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pEBCD，脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染奶牛胎兒成纖維細(xì)胞G418，之后檢測(cè)到重組HBD-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)。王慧等[37]構(gòu)建HBD-2真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到HBD-2基因成功轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，表達(dá)的HBD-2有較強(qiáng)的抗金黃色葡萄球菌活性。曹玉紅等分別將重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1+/HBD4和pEGFP-N2/HBD4導(dǎo)入COS-7和HEK293細(xì)胞，均檢測(cè)到了HBD4蛋白的表達(dá)，并具有較強(qiáng)的殺菌作用[38-39]。

與其它真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，HBD目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與天然的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎完全相同，并且在蛋白合成起始信號(hào)、加工、分泌等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。但是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成本相對(duì)較高，技術(shù)復(fù)雜，表達(dá)過(guò)程中存在著潛在的動(dòng)物病毒的污染[40]。

3 展 望

人β-防御素因具有廣譜的抗菌活性，在抵御病原微生物的侵襲、參與免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，且病原菌對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性，因此它們有望成為一類新型的抗菌藥物，從而解決細(xì)菌的耐藥性和抗菌素的毒副作用等問(wèn)題。通過(guò)基因工程技術(shù)制備HBD的研究，將會(huì)為今后制備類似藥物奠定基礎(chǔ)，指導(dǎo)抗微生物肽類藥物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)，為其提供理想的分子設(shè)計(jì)骨架和模板。新型、高效、低毒、廣譜的HBD將會(huì)在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加劑、動(dòng)植物抗病轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域發(fā)揮出重要的作用，對(duì)人類的健康和生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

表4 各種表達(dá)系統(tǒng)比較

表4對(duì)HBD基因工程重組表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了比較，HBD在大腸桿菌中雖能高效表達(dá)但易形成包涵體，且后期分離純化過(guò)程比較繁瑣，表達(dá)后還需要活化才有生物活性；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成本相對(duì)較高，技術(shù)復(fù)雜，表達(dá)過(guò)程中存在著潛在的動(dòng)物病毒的污染；畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因操作簡(jiǎn)單、高水平分泌表達(dá)外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)產(chǎn)物HBD有較好的抑菌活性等優(yōu)點(diǎn)。隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入研究及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，所有的表達(dá)系統(tǒng)都可以在功能上有進(jìn)一步的改善。但是，一些表達(dá)系統(tǒng)本身固有的缺陷也不能忽略，因此在選擇HBD表達(dá)系統(tǒng)時(shí)應(yīng)綜合考慮表達(dá)水平、表達(dá)周期、安全性、蛋白質(zhì)性質(zhì)等因素。

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