田 暢, 蔣 倩, 王 楓, 李夢瑤, 賈曉玲, 熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室, 江蘇 南京 210095)

哺乳動物中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)在蛋白質(zhì)和DNA互作、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等生命活動中表現(xiàn)出不同的功能性，在植物中此酶可能與哺乳動物具有相似的調(diào)控模式[1]。高等植物的G3PDH分為磷酸化和非磷酸化兩大類，是維持生命活動的最基本酶之一，主要參與糖酵解、糖異生以及卡爾文循環(huán)等能量代謝途徑。按定位來說可以分為質(zhì)體型和胞質(zhì)型兩類，磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在質(zhì)體及胞質(zhì)中均存在，包含GAPC、GAPCp和GAPA/B 三類同工型蛋白質(zhì)[2]；非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(np-G3PDH)定位于細(xì)胞質(zhì)中，為4個同種亞基GAPC組成的多聚體[3]，是催化糖酵解“支路”反應(yīng)的酶，具體反應(yīng)過程為np-G3PDH氧化3-磷酸甘油醛生成3-磷酸甘油酸，該反應(yīng)是依賴于NADP+并伴有NADPH生成的不可逆反應(yīng)[4]。np-G3PDH的氨基酸序列與磷酸化的GAPDH的氨基酸序列同源性很低，但與各種真菌和真核生物的醛脫氫酶(ALDHs)有約30%的氨基酸序列同源性[5]。目前已從多種生物中克隆出np-G3PDH基因序列，如菠菜(SpinaciaoleraceaLinn.)[6]、玉米(ZeamaysLinn.)[7]、小麥(TriticumaestivumLinn.)[8]、擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[9]和皺葉煙草(NicotianaplumbaginifoliaViv.)[10]等，np-G3PDH基因具有高度保守性，通過不同物種np-G3PDH基因核苷酸或氨基酸序列的比較，可為物種分類及發(fā)育關(guān)系研究提供一定的證據(jù)。

芹菜(ApiumgraveolensLinn.)是常用蔬菜之一，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素以及鈣、磷、鐵、鈉等元素，栽培歷史悠久、栽培區(qū)域廣泛且品種豐富。南京六合地區(qū)栽培的品種‘六合黃心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)具有植株矮小、晚熟、喜濕、耐肥、耐熱和耐寒等特點；天津津南地區(qū)栽培的品種‘津南實芹’(‘Jinnan Shiqin’)具有植株直立、抽薹晚、抗逆性強和適應(yīng)性強等特點；而引進(jìn)品種‘文圖拉’(‘Ventura’)則具有株型大、質(zhì)地脆嫩和抗病能力強等特點，具有典型的西芹特征。作者以上述3個芹菜品種為實驗材料，克隆獲得芹菜非磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因Agnp-G3PDH并進(jìn)行序列分析；利用生物信息學(xué)方法推導(dǎo)其氨基酸序列并對氨基酸組成、親水性/疏水性及其與其他物種的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行預(yù)測和分析；通過實時定量PCR對該基因的組織表達(dá)特異性及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行了研究，以期為芹菜Agnp-G3PDH基因功能的深入研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室傘形科(Apiaceae)植物課題組保存；質(zhì)粒載體pMD18-T Vector、ExTaqDNA聚合酶和各類限制性內(nèi)切酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

供試芹菜品種‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院江浦實驗農(nóng)場，保存于人工氣候室中，采集成熟的根、莖、葉和花用于總RNA提取及cDNA合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕從3個品種的根、莖、葉和花中提取總RNA，利用Prime Script RT reagent Kit試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2Agnp-G3PDH基因的克隆 根據(jù)GenBank中芹菜的np-G3PDH基因(登錄號AF196292)設(shè)計引物NXR37(序列為5′-ATGGCTGGAAGTGGTGTGTATG-3′)和NXR38(序列為5′-CTAGCCCATGGTATAAGAA GGGGA-3′)。然后分別以‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’的cDNA為模板進(jìn)行擴增、克隆和測序[11]。

1.2.3 序列分析 用BLASTp及DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對，相關(guān)種類的np-G3PDH氨基酸序列均來自NCBI數(shù)據(jù)庫。利用DNAMAN和http:∥web.expasy.org網(wǎng)站相關(guān)軟件進(jìn)行親水性/疏水性鑒定和氨基酸類型等相關(guān)分析，利用Signal P軟件分析蛋白信號肽，蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析用http：∥www.expasy.org網(wǎng)站相關(guān)軟件完成。利用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，然后用MEGA 5.0軟件對進(jìn)化樹進(jìn)行編輯并生成報告圖形[12]。

1.2.4 脅迫處理及實時定量PCR反應(yīng) 分別對3個品種的2月齡幼苗各20株進(jìn)行高溫、低溫、鹽和干旱脅迫處理。其中，高溫和低溫脅迫處理分別將植株置于38 ℃光照培養(yǎng)箱和4 ℃冰箱中處理2 h，鹽和干旱脅迫處理則分別將植株用0.2 mol·L-1NaCl和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20%PEG溶液室溫處理2 h。

分別取經(jīng)高溫、低溫、鹽和干旱脅迫處理后3個芹菜品種植株的葉片進(jìn)行實時定量PCR分析，各3次重復(fù)。根據(jù)克隆獲得的‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’的Agnp-G3PDH基因序列分別設(shè)計表達(dá)檢測上游引物NRX37BDF1(序列為5′-AGGGACAT CAACAAAGCAATG-3′)和下游引物NRX31BDR1(序列為3′-CATATTGATGCTGTT TGTGATG-5′)；以芹菜actin基因為內(nèi)參設(shè)計表達(dá)檢測上游引物ACTIN-F(序列為5′-CTTCCTGCCATATATGATTGG-3′)和下游引物ACTIN-R(序列為3′-GCCAGCACCTCGATCT TCATG-5′)。采用SYBR PremixExTaq試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)；相對定量使用參照基因的ΔCt法，表達(dá)差異用2-ΔΔCt表示。其中，ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ctactin，ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照(式中，Ct表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。

2 結(jié)果和分析

2.1 芹菜Agnp-G3PDH基因的序列分析及其編碼的氨基酸序列分析結(jié)果

分別以品種‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’嫩葉的cDNA為模板，用引物NRX37和NRX38分別擴增出1段長約1 500 bp的擴增產(chǎn)物(圖1)，經(jīng)測序得到3個芹菜品種的Agnp-G3PDH基因序列及其編碼的氨基酸序列(圖2、圖3和圖4)。

序列測定與分析結(jié)果顯示：3個芹菜品種的Agnp-G3PDH基因均含有1個長度為1 491 bp的開放閱讀框(ORF，open reading frame)，編碼496個氨基酸。3個品種的Agnp-G3PDH基因序列中存在84個堿基差異，編碼的氨基酸序列存在14個氨基酸位點的改變；其中，品種‘六合黃心芹’與‘文圖拉’間的Agnp-G3PDH基因序列有6個不同位點、編碼的氨基酸序列有4個氨基酸位點改變；而品種‘津南實芹’的Agnp-G3PDH基因序列與其他2個品種差異較大。

M: DL2000 marker; 1: 芹菜品種‘六合黃心芹’ A. graveolens ‘Liuhe Huangxinqin’; 2: 芹菜品種‘津南實芹’ A. graveolens ‘Jinnan Shiqin’; 3: 芹菜品種‘文圖拉’ A. graveolens ‘Ventura’.

圖2 芹菜品種‘六合黃心芹’Agnp-G3PDH基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

圖3 芹菜品種‘津南實芹’Agnp-G3PDH基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

圖4 芹菜品種‘文圖拉’Agnp-G3PDH基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

通過品種‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’Agnp-G3PDH基因預(yù)測的3個芹菜品種Agnp-G3PDH蛋白的理論相對分子質(zhì)量分別為53 201.6、53 051.4和52 960.3，理論等電點分別為pI 7.49、 pI 7.86和pI 8.12，酸性氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)與堿性氨基酸(賴氨酸+組氨酸+精氨酸)的比值分別為51/61、50/61和49/61，可見，在3個芹菜品種的Agnp-G3PDH蛋白中堿性氨基酸數(shù)量均大于酸性氨基酸數(shù)量。

對3個芹菜品種的預(yù)測Agnp-G3PDH蛋白的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示：3個芹菜品種Agnp-G3PDH蛋白的氨基酸序列的親水性/疏水性基本一致，均具有親水性與疏水性雙重特性，均為疏水性蛋白。

2.2 芹菜Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與其他植物的np-G3PDH氨基酸序列比對結(jié)果

對芹菜品種‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’的Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果顯示：3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列均具有高度的保守區(qū)域，同源性達(dá)99.09%。BLASTp分析結(jié)果顯示(圖6)：品種‘六合黃心芹’Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列屬于ALDH-SF超家族，歸為ALDHF11家族，是NAD(P)+依賴醛脫氫酶，具有多個NADP結(jié)合位點，屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白序列。BLASTp分析結(jié)果還顯示：3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)[13]、黃瓜(CucumissativusLinn.)、葡萄(VitisviniferaLinn.)、可可(TheobromacacaoLinn.)、鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.)、SolanumlycopersicumLinn.、二穗短柄草〔Brachypodiumdistachyum(Linn.) Beauv.〕、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕、節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)、烏拉爾圖小麥(TriticumurartuTum.)[14]等種類的np-G3PDH氨基酸序列具有很高的相似度。

3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與其他11種植物np-G3PDH氨基酸序列的多重比對結(jié)果(圖7)顯示：它們的氨基酸序列同源性達(dá)93.81%，表明np-G3PDH蛋白在進(jìn)化上高度保守。

對3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列和其他11種植物的np-G3PDH氨基酸序列組成及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。分析結(jié)果顯示：僅大豆np-G3PDH氨基酸序列的氨基酸殘基數(shù)為497，3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列和其他10種植物的np-G3PDH氨基酸序列的氨基酸殘基數(shù)均為496，且均不存在信號肽序列與剪切位點；理論相對分子質(zhì)量為52 000～54 000，理論等電點pI 6～pI 8；脂肪族氨基酸所占比例較高；芹菜品種‘津南實芹’Agnp-G3PDH基因編碼的蛋白質(zhì)與毛果楊np-G3PDH蛋白的總平均疏水性(GRAVY)分別為-0.001和-0.015，其他植物np-G3PDH蛋白的總平均疏水性均為正值。

圖5 3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列的親水性(A)和疏水性(B)比較

圖6 芹菜品種‘六合黃心芹’Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列保守域預(yù)測

2.3 芹菜Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列同源進(jìn)化分析

根據(jù)BLASTp檢索結(jié)果，選取上述11種植物的np-G3PDH氨基酸序列與3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建同源進(jìn)化樹，結(jié)果見圖8。分析結(jié)果顯示：同屬于禾本科(Gramineae)的節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥和二穗短柄草以及同屬于豆科(Leguminosae)的大豆、鷹嘴豆以及蒺藜苜蓿均各自聚在同一分支中，表明屬于同科的植物其np-G3PDH氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系較近；而3個芹菜品種也聚在同一分支中，表明3個芹菜品種的Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系較近，并且與屬于楊柳科(Salicaceae)的毛果楊的np-G3PDH氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系也較近。

2.4 芹菜Agnp-G3PDH基因的表達(dá)特性分析

2.4.1 在不同組織中表達(dá)量的差異 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示(圖9)：芹菜Agnp-G3PDH基因在品種‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’根、莖、葉和花中的表達(dá)量差異較大。品種‘六合黃心芹’不同組織中Agnp-G3PDH基因相對表達(dá)水平由高到低依次為根、莖、葉、花；其中，在根中的相對表達(dá)水平極顯著高于莖、葉和花；在葉與花間的相對表達(dá)水平也有顯著差異。品種‘津南實芹’不同組織中Agnp-G3PDH基因相對表達(dá)水平由高到低依次為葉、根、莖、花；其中，在莖和花間的相對表達(dá)水平無顯著差異，在其他組織間的相對表達(dá)水平有極顯著差異。品種‘文圖拉’不同組織中Agnp-G3PDH基因相對表達(dá)水平由高到低依次為花、根、葉、莖，且在各組織中的相對表達(dá)水平均有極顯著差異。

1. 品種‘津南實芹’ A. graveolens ‘Jinnan Shiqin’; 2. 品種‘六合黃心芹’ A. graveolens ‘Liuhe Huangxinqin’; 3. 品種‘文圖拉’ A. graveolens ‘Ventura’; 4. 蒺藜苜蓿Medicago truncatula Gaertn.; 5. 毛果楊Populus trichocarpa Torr. & Gray; 6. 黃瓜Cucumis sativus Linn.; 7. 葡萄Vitis vinifera Linn.; 8. 可可Theobroma cacao Linn.; 9. 鷹嘴豆Cicer arietinum Linn.; 10. Solanum lycopersicum Linn.; 11. 二穗短柄草Brachypodium distachyum (Linn.) Beauv.; 12. 大豆Glycine max (Linn.) Merr.; 13. 節(jié)節(jié)麥 Aegilops tauschii Coss.; 14. 烏拉爾圖小麥Triticum urartu Tum.

表1 3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的蛋白質(zhì)與其他植物np-G3PDH蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)

圖8 3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與其他植物np-G3PDH氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖中不同的大寫和小寫字母分別表示同一品種不同組織間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05) The different capitals and small letters in the figure indicate the extremely significant (P<0.01)and significant (P<0.05) differences among different tissues of the same cultivar, respectively.

2.4.2 經(jīng)不同脅迫處理后表達(dá)量的差異 經(jīng)高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、鹽(0.2 mol·L-1NaCl)和干旱(20%PEG)脅迫處理后3個芹菜品種葉片中Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平見表2。由表2可見：經(jīng)不同脅迫處理后3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因的表達(dá)量有明顯差異。經(jīng)高溫和低溫處理后品種‘六合黃心芹’葉片中Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平均極顯著高于對照，但經(jīng)鹽脅迫處理后其相對表達(dá)水平與對照差異不顯著，而經(jīng)干旱脅迫處理后其相對表達(dá)水平極顯著低于對照。

經(jīng)高溫脅迫和干旱脅迫處理后品種‘津南實芹’葉片中Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平極顯著高于對照，經(jīng)鹽脅迫處理后其相對表達(dá)水平顯著高于對照，而經(jīng)低溫脅迫處理后其相對表達(dá)水平極顯著低于對照。

經(jīng)鹽脅迫處理后品種‘文圖拉’葉片中Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平與對照差異不顯著，但經(jīng)高溫、低溫及干旱脅迫處理后其相對表達(dá)水平均極顯著低于對照。

表2 經(jīng)不同脅迫處理后3個芹菜品種葉片中Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平比較

3 討 論

研究結(jié)果表明：從芹菜品種 ‘六合黃心芹’、‘津南實芹’和‘文圖拉’中分離得到的Agnp-G3PDH基因序列具有高度同源性，在芹菜中該基因進(jìn)化非常保守，大部分基因位點突變屬于同義突變。品種‘六合黃心芹’和‘文圖拉’的Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列同源性更高，表明供試3個芹菜品種中品種‘六合黃心芹’與‘文圖拉’進(jìn)化關(guān)系更為接近。3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與蒺藜苜蓿和毛果楊等其他11種植物的np-G3PDH氨基酸序列的同源性為93.81%，且3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因編碼的氨基酸序列與毛果楊的進(jìn)化關(guān)系較近，葡萄科(Vitaceae)的葡萄與禾本科植物的進(jìn)化關(guān)系較近，而屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)的黃瓜與屬于茄科(Solanaceae)的Solanumlycopersicum聚在同一個分支，表明np-G3PDH氨基酸序列的進(jìn)化也是非常保守的，這可能與np-G3PDH參與糖酵解等能量代謝途徑并生成光呼吸及甘露醇等生物合成過程所必需的還原劑NADPH的重要功能有關(guān)[15-16]。

供試3個芹菜品種中Agnp-G3PDH基因的表達(dá)差異較大，表現(xiàn)出明顯的組織特異性，這可能與品種差異有關(guān)。經(jīng)不同脅迫處理后3個芹菜品種Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平也有明顯差異，其中，品種‘文圖拉’Agnp-G3PDH基因的表達(dá)對脅迫處理的響應(yīng)與另2個芹菜品種明顯不同。在不同脅迫處理后品種‘文圖拉’Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平與對照差異不顯著或極顯著低于對照，而品種‘六合黃心芹’在高溫和低溫脅迫處理后以及品種‘津南實芹’在高溫和干旱脅迫處理后Agnp-G3PDH基因的相對表達(dá)水平均極顯著高于對照。

Gao等[17]的研究結(jié)果表明：np-G3PDH的代謝與甘露糖-6-磷酸還原酶的表達(dá)水平有緊密聯(lián)系，并且甘露醇合成的NADPH供給受np-G3PDH的嚴(yán)格控制。甘露醇參與植物體的抗逆代謝機制響應(yīng)，如抗鹽脅迫[18]、抗干旱脅迫、抗低溫脅迫[19]和抗氧化脅迫[20]等，同時在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及果實成熟等方面也具有重要作用[21]。推測np-G3PDH通過影響甘露醇代謝進(jìn)而在植物體的生長發(fā)育及抗逆代謝機制中發(fā)揮作用。

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