李瑞芳,管志玉,付玉榮,伊正君

很多研究已經發(fā)現，TLR7會增強宿主抗感染免疫應答能力。在感染早期，TLR7可以通過誘導細胞因子的分泌來增強機體快速地對病原體感染做出全身性免疫應答[1]，以有助于清除細菌、病毒的感染[2-3]。ssRNA作為TLR7的配體，可以有效的激活TLR7，刺激免疫細胞表達TLR7增強細胞免疫應答。Monica A Delgado指出，卡介苗(BCG)感染巨噬細胞后，用TLR7配體咪喹莫特或ssRNA治療細胞或使細胞饑餓后，顯示TLR7能通過誘導自噬減少胞內BCG。但是，在結核分枝桿菌感染中TLR7的作用至今未有報道。本研究以小鼠巨噬細胞為模型，結核分枝桿菌感染后加入化學合成的TLR7激活基序ssRNA激活TLR7，研究TLR7在結核分枝桿菌感染中的影響，以期能為結核分枝桿菌的防治提供幫助。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞株 小鼠巨噬細胞RAW264.7，濰坊醫(yī)學院醫(yī)學免疫學實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(GBICO公司)；胎牛血清(GBICO公司)；羅氏培養(yǎng)基(實驗室自配)；ssRNA(本實驗室構建)；異煙肼；胰酶；磷酸鹽緩沖液PBS(實驗室自配)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠IL-4 ELISA試劑盒、小鼠IL-12 ELISA試劑盒(北京達科為生物科技有限公司)；結核桿菌(TB)核酸測定試劑盒(上海之江生物科技有限公司)，所用試劑均為國產分析純。

1.1.3實驗儀器 Fax-2100型酶標儀，倒置顯微鏡(Olympus公司)，Thermo型CO2培養(yǎng)箱，HHB114-20型恒溫培養(yǎng)箱，Sirion200型掃描電鏡(FEI公司)。

1.2方法

1.2.1TLR7對結核分枝桿菌吞噬率的影響 細胞用完全1640培養(yǎng)基稀釋至3×105/mL，2 mL /孔加入24孔板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)至細胞牢固貼壁，次日，用新鮮的完全1640培養(yǎng)基換液，1 mL /孔。實驗細菌接種于羅氏平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)約15 d，挑取單個菌落進行研磨，0.9%生理鹽水反復淘洗后自然沉淀3次，取上清，調整細菌濃度至1.5×108/ mL，沉淀及所有用具高壓滅菌后丟棄。取20 μL/孔加入細胞上清中。細胞分組處理，每組重復3孔。處理如下：感染后未激活組、感染后加入ssRNA組(20 μL/孔，終濃度10 μg/mL)、饑餓組(即感染前用無血清1640培養(yǎng)基換液)、感染后加入異煙肼組(20 μL/孔，終濃度10 μg/mL)。處理后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集感染后0 h、1 h、3 h、5 h細胞上清，煮沸后離心取上清液進行熒光定量PCR檢測。定量PCR反應體系如下：36 μLTB核酸熒光PCR檢測混合液(含有dNTP、1對引物和1條熒光探針的溶液)，0.4 μL酶(Tag+UNG)，4 μL細胞上清。反應體系按下列參數進行：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，單點熒光檢測在60 ℃，熒光通道檢測選擇FAM通道。

1.2.2TLR7對結核分枝桿菌感染細胞作用的形態(tài)學觀察 取5×106個細胞，200 mL細胞培養(yǎng)瓶內過夜培養(yǎng)，感染3 h后加入50 μL ssRNA(終濃度10 μg/mL)，同時設立感染后未激活對照和未感染正常細胞對照，細胞于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。掃描電鏡觀察細胞形態(tài)，步驟如下：細胞用0.3%胰酶消化，離心，取細胞沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH7.4 無菌PBS重懸后移入1.5 mL EP管，離心；加入0.5 mL 4 ℃預冷3%戊二醛預固定，上清吸棄，加1 mL 預冷3%戊二醛，4 ℃過夜。然后經脫水、浸透、包埋聚合、切片(厚度為70 nm)及染色，最后掃描電鏡觀察。

1.2.3TLR7對殺菌活性的影響 細胞過夜培養(yǎng)，次日換液，細菌感染3 h后分組處理(分組同1.2.1 TLR7對結核分枝桿菌吞噬率的影響)，每組重復3次，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育36 h，收集細胞上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，細胞用無菌1% Tritonx-100裂解，500 μL/孔，完全裂解后，吹打混勻，0.01 mol/L pH7.4 無菌PBS 1∶20稀釋，取100 μL菌液涂于羅氏平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)19 d后菌落計數。

1.2.4TLR7對結核分枝桿菌感染細胞作用的細胞因子影響 細胞于24孔板過夜培養(yǎng)，6×105/孔，次日換液，細菌感染3 h后分組處理(分組同1.2.1 TLR7對結核分枝桿菌吞噬率的影響)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h、48 h，收集細胞上清。按試劑盒說明操作，分別檢測細胞上清中IL-12、IL-4與TNF-α的含量。

2 結 果

2.1TLR7對結核分枝桿菌吞噬率的影響 RT-PCR法檢測不同時間感染后4個組的細胞上清結果顯示，4組均在感染后3 h CT值最高(P>0.05)，即細胞上清中細菌濃度最低，而感染5 h后CT值均略有下降，因此以下試驗均選定感染時間為3 h。如圖1所示。

2.2TLR7對結核分枝桿菌感染細胞作用的形態(tài)學測定 治療3 h后掃描電鏡觀察，正常細胞加入TLR7激活基序ssRNA后細胞形態(tài)未發(fā)生變化，結構完整，胞核邊緣整齊，線粒體清晰(圖2，D)，與正常細胞比較(圖2，A)無顯著變化；感染后加入TLR7激活基序ssRNA治療組感染組比較線粒體相對清晰，吞噬小泡明顯增多(圖2，C)，而感染組細胞出現較多的細胞碎片，線粒體不清晰(圖2，B)。

圖1 TLR7對結核分枝桿菌吞噬率的影響

圖2 掃描電鏡觀察不同處理下的細胞形態(tài)變化

2.3TLR7對殺菌活性的影響 感染細胞用不同方法處理后，細胞經1%Tritonx-100無菌裂解于羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后活菌落計數顯示，加異煙肼處理后菌落數量最少(P>0.05)，而ssRNA組菌落數量與異煙肼組差別不大(P>0.05)，但是與感染組相比明顯減少(P<0.05)。結果見圖3所示。

圖3 TLR7對殺菌活性的影響

2.4TLR7對結核分枝桿菌感染細胞的細胞因子影響 感染3 h后用不同方法處理細胞檢測細胞上清中的IL-12、IL-4與TNF-α的含量，結果顯示，與感染組比較，處理36 h后，ssRNA組IL-12(P<0.05)、IL-4(P<0.05)上升，處理48 h后IL-4(P< 0.05)下降，TNF-α的含量上升(P<0.05)；異煙肼組在處理48 h后顯示IL-4(P< 0.05)下降、IL-12(P<0.05)上升。結果見圖4所示。

3 討 論

結核分枝桿菌是胞內感染菌[4]，感染宿主后巨噬細胞在防御方面起重要作用，是結核分枝桿菌入侵宿主后侵入的首要細胞。巨噬細胞表達TLRs識別病原體并且通過誘導自噬等機制清除胞內病原體[5]。卡介苗(BCG)感染巨噬細胞后，用TLR7配體咪喹莫特或ssRNA治療細胞或使細胞饑餓后，顯示TLR7能通過誘導自噬減少胞內BCG。核酸樣結構是盡人皆知的TLR7/8配體，ssRNA可以有效的激活TLR7，ssRNA作為TLR7激動劑可以發(fā)展成作為誘導細胞免疫應答的佐劑[6-7]。本文選用小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞作為細胞模型，加入本實驗前期構建TLR7激活基序ssRNA檢測TLR7在結核分枝桿菌感染中的殺菌作用。巨噬細胞有吞噬能力，但何時吞噬作用最強還未知，本實驗設定3個感染時間段1 h、3 h、5 h，定量PCR法檢測細胞上清中的細菌數量，重復3次，取平均值。實驗設定4組，分別為感染后未激活對照組(以下簡稱感染組)、感染后加ssRNA組(以下簡稱ssRNA組)、饑餓組、感染后加異煙肼組(以下簡稱異煙肼組)。結果顯示，細胞吞噬細菌后每組CT3 h值均高于CT1 h值和CT5 h值(P>0.05)，說明實驗設定的3個時間段，3 h時吞噬能力最強，因此下步實驗均選定感染時間為3 h。另外，從CT3 h值-CT1 h值結果看，差值最大的為ssRNA組，其次為感染組、異煙肼組、饑餓組，由此證明ssRNA組吞噬能力較強，說明TLR7有增強細胞吞噬細菌的能力。從CT5 h值看，每組CT值均下降，細胞狀態(tài)也不如感染后3 h，可能感染細菌濃度偏高造成細胞裂解或其他原因使得細菌片段又釋放入上清中；而ssRNA組CT5 h值高于其他組，細胞狀態(tài)也好于其他組，這可能與ssRNA激活TLR7有抑制細胞壞死或凋亡的作用，而后期的掃描電鏡實驗也證明ssRNA組細胞狀態(tài)明顯好于感染組，兩次實驗結果相符。電鏡觀察自噬小體表明，治療3 h后，ssRNA組細胞形態(tài)明顯好于感染組，而且吞噬小泡增多，并且有多個細胞顯示細胞處于分裂狀態(tài)，這是否顯示TLR7能促進細胞分裂也未可知，而且未感染加ssRNA對照組細胞狀態(tài)與正常細胞無差別，說明TLR7激活基序ssRNA對細胞沒有不良刺激，結果表明，TLR7是可以通過自噬機制殺滅結核分枝桿菌的。為了進一步研究TLR7是否有殺菌的能力，本實驗將細胞感染后用不同方法處理，最后裂解細胞計數胞內活菌數量。經培養(yǎng)后菌落計數顯示，用不同方法處理細胞36 h后，細胞內活菌數量最低的為異煙肼組(P>0.05)，其次是ssRNA組、饑餓組、感染對照組，此結果證明TLR7確實能增強細胞殺結核分枝桿菌的能力。雖然異煙肼組和ssRNA組菌落數量均明顯低于感染對照組，但是菌落數量還是偏多，這可能是由于本實驗加入的藥量偏低并且處理時間偏短的原因。

圖4 TLR7對結核分枝桿菌感染細胞的細胞因子影響

TLR7刺激樹突狀細胞和巨噬細胞的炎癥應答，增強CD8+T細胞的細胞溶解活性，可通過刺激自噬、產生NO、誘導產生趨化型細胞因子等清除微生物。本實驗已證明TLR7能清除胞內結核分枝桿菌，但TLR7的殺結核分枝桿菌機理此前還未知。為揭示TLR7清除結核分枝桿菌的機理，本實驗繼續(xù)從細胞的免疫機理來研究。從檢測細胞因子看，ssRNA組IL-12(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)、IL-4(P<0.05)的含量在不同時間點高于感染組，從結果看，TLR7還可以通過調節(jié)細胞因子殺菌。研究結果提示，TLR7確實有增強細胞殺結核桿菌的能力，可以通過刺激細胞產生自噬體和調節(jié)細胞因子產生等機制清除胞內結核分枝桿菌，而激活基序ssRNA是否可以通過抑制細胞壞死或凋亡以維持細胞生存還需要繼續(xù)研究。本實驗室構建的TLR7激活基序ssRNA可以用于治療結核分枝桿菌，具體治療方案還需要繼續(xù)研究，后期研究期望能為結核分枝桿菌的治療找到新的突破點，也為臨床用藥提供理論依據。

參考文獻：

[1]Baccarella A, Fontana MF, Chen E, et al. Toll-like receptor 7 mediates early innate immune responses to malaria[J]. Infect Immunol, 2013, 81(12): 4431-4442. DOI: 10.1128/IAI.00923-13

[2]Kaminski MM, Ohnemus A, Cornitescu M, et al. Plasmacytoid dendritic cells and Toll-like receptor 7-dependent signalling promote efficient protection of mice against highly virulent influenza A virus[J]. J Gen Virol, 2012, 93: 555-559. DOI: 10.1099/vir.0.039065-0

[3]Lebel ME, Daudelin JF, Chartrand K, et al. Nanoparticle adjuvant sensing by TLR7 enhances CD8+T cell mediated protection fromListeriaMonocytogenesinfection[J]. J Immunol, 2014, 192(3): 1071-1078. DOI: 10.4049/jimmunol.1302030

[4]Huynh KK, Joshi SA, Brown EJ. A delicate dance: host response to mycobacteria[J]. Curr Opin Immunol, 2011, 23(4): 464-472. DOI: 10.1016/j.coi.2011.06.002

[5]De Meyer I, Martinet W, Schrijvers DM, et al. Toll-like receptor 7 stimulation by imiquimod induces macrophage autophagy and inflammation in atherosclerotic plaques[J]. Basic Res Cardiol, 2012, 107(3): 1-13. DOI: 10.1007/s00395-012-0269-1

[6]Campbell GR, Spector SA. Vitamin D inhibits human immunodeficiency virus type 1 andMycobacteriumtuberculosisinfection in macrophages through the induction of autophagy[J]. PLoS Pathog, 2012, 8: 1-13. DOI: 10.1371/journal.ppat.1002689

[7]Cheallaigh CN, Keane J, Lavelle EC, et al. Autophagy in the immune response to tuberculosis: clinical perspectives[J]. Clin Exp Immunol, 2011, 164(3): 291-300. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2011.04381.x