陳 成，魏 東，李恪梅，付麗麗，黃長江，王國治

布魯氏菌簡稱布氏菌(Brucella)，是革蘭氏陰性，兼性胞內(nèi)寄生菌，具有侵襲力強、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點。布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布魯氏菌屬引起的一類人獸共患疾病，嚴重威脅著人類和多種動物的生命安全[1]。據(jù)調(diào)查，全世界200多個國家和地區(qū)已經(jīng)有170多個存在布病疫情[2-4]，在我國布病波及28個省市區(qū)，并且近年疫情反彈，死灰復燃，每年造成近千萬元的損失。

目前，雖然治療布病主要使用抗生素，但是長期應用抗生素容易造成細菌耐藥[5]。因此，預防接種布氏疫苗仍是我國目前預防布氏菌感染和傳播最實際、最有效的方法[6]。疫苗接種的方法有滴鼻、注射、氣霧及皮膚劃痕等[7-8]。我國從1965年開始采用皮上劃痕接種牛種弱毒株104M菌株[9]。該方法接種復雜，不能定量接種，常伴有局部或異常反應，被接種者皮膚有損傷和劃痕時疼痛，遺留疤痕不易被接受。與皮上劃痕比較，皮內(nèi)注射接種方式具有定量接種、節(jié)省菌苗、操作簡單，同時又能改善被接受者痛苦的優(yōu)點。改善疫苗的免疫途徑是疫苗研究的熱點，國內(nèi)外有學者對布氏疫苗免疫方法進行深入的研究和探索[10]。

本次研究對豚鼠進行皮內(nèi)注射和皮上劃痕兩種方式免疫布氏菌活疫苗，通過體液免疫、細胞免疫和免疫保護力試驗結(jié)果來比較兩種免疫方式的免疫效果，為皮內(nèi)注射布氏菌活疫苗取代傳統(tǒng)人用皮上劃痕布氏菌活疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級Hartly豚鼠，雌性，300～350 g，共15只，由中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)實驗動物中心提供( 實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK( 京) 2009-0017) ，飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

1.1.2菌種 皮內(nèi)和劃痕用布氏活疫苗為皮上劃痕人用布氏菌活疫苗、羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

1.1.3變應原 Br-PPD蛋白，由中檢院結(jié)核病疫苗室提供，制備方法見參考文獻[11]。

1.1.4試劑 布氏菌培養(yǎng)基(腦心瓊脂購自美國BD公司)、牛血清白蛋白(BSA)美國Sigma公司購進、堿性磷酸酶標記山羊抗豚鼠IgG(美國Bethyl公司)、pNPP底物顯色液(SurModics)

1.1.5實驗儀器 生物安全柜(telstar bio-Ⅱ-A)、酶標儀(Labsystems Dragon-MK3)、恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器-DH6000AB型)、高速離心機(德國eppendorf-5415D)

1.1.6實驗耗材 15 mL離心管，50 mL離心管、96孔培養(yǎng)板。

1.2方法

1.2.1分組及免疫 將15只300～350 g體重SPF級豚鼠隨機分成3組，每組5只。第1組為皮內(nèi)注射組(5×107/只)；第2組為皮上劃痕組(9.5×109/只)；第3組為陰性對照組(生理鹽水)。皮內(nèi)接種即先將豚鼠右大腿外側(cè)脫毛，然后用酒精擦拭后，待酒精揮干，后肢皮內(nèi)注射，劑量為100 μL/只；劃痕接種即先將豚鼠右大腿外側(cè)脫毛，然后用酒精擦拭后，待酒精揮干，用1 mL無菌注射器針頭在免疫部位劃#字，確保表皮開裂后，在#字上均勻涂布菌液50 μL/只，等待5 min后，用無菌醫(yī)用干棉球吸干表面菌液完成免疫。

免疫4周后，對每只豚鼠進行心臟抽血，分離血清，-20 ℃保存，用于豚鼠ELISA抗體檢測。

1.2.2抗體水平檢測 用間接 ELISA法檢測小鼠血清IgG的效價。以滅活布氏菌體5×108/mL的濃度包被96孔酶標板，4 ℃過夜；以PBST 300 μL 洗板5次，用1%的BSA封閉(200 μL/孔)，37 ℃靜置1 h；每孔加入100 μL的50×開始倍比稀釋的待檢血清，37 ℃靜置1 h；按1∶2 500稀釋的堿性磷酸酶標記山羊抗豚鼠IgG，洗板后100 μL/孔加入，37 ℃靜置1 h；洗板，加入100 μL/孔的PNPP底物顯色液，室溫避光28 min后加入100 μL/孔終止液(3 mol/L的NaOH)終止反應；在波長為405 nm處檢測吸光值A405。

1.2.3遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH) 采血3 d后，暴露豚鼠背部皮膚，除毛，皮內(nèi)注射PPD變態(tài)反應原，注射劑量均為每只30 μg，每點0.2 mL。注射24 h和48 h后分別觀察注射部位出現(xiàn)紅腫反應，并測量平均硬結(jié)反應直徑，以縱、橫直徑相加除以2≥5 mm為陽性標準，計算陽性反應率。

1.2.4布魯氏菌活苗免疫保護力檢測 豚鼠皮膚實驗3 d后，對每只豚鼠皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5×108CFU/只，攻擊部位為后肢皮下。3周后斷頸處死豚鼠，無菌取脾臟，通過脾臟細菌計數(shù)比較布魯氏菌活苗兩種免疫方式的保護效果。

2 結(jié) 果

2.1血清中總IgG水平測定 兩種方式免疫豚鼠均能產(chǎn)生高滴度抗體，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=593.628，P<0.05，n=15)。但皮內(nèi)組與劃痕組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.365，P>0.05，n=10)。說明兩種方式免疫產(chǎn)生的體液免疫效果無明顯差異，結(jié)果見圖1。

2.2遲發(fā)型變態(tài)反應試驗結(jié)果(DTH) 皮內(nèi)組和劃痕組豚鼠針對PPD抗原24 h及48 h的DTH陽轉(zhuǎn)率均為100%，結(jié)果見表1。

3 討 論

兩種方式免疫豚鼠抗體檢測結(jié)果表明，體液免疫中的皮內(nèi)注射組和皮上劃痕組均能產(chǎn)生高滴度的IgG抗體，劃痕組產(chǎn)生的抗體效價幾何均數(shù)為11 143，皮內(nèi)注射組抗體效價幾何均數(shù)為9 700。從效價水平來看，劃痕組略高于皮內(nèi)組，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者間差異無統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果顯示皮內(nèi)注射免疫和皮上劃痕免疫均能誘導較強的體液免疫應答，兩者體液免疫效果相近。

圖1 血清IgG抗體效價

表1 Br-PPD免疫4周后皮膚試驗結(jié)果

布氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，寄生于單核巨噬細胞內(nèi)，能夠逃脫宿主細胞免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，所以細胞免疫是機體對抗布病主要的免疫方式[12]。皮膚變態(tài)反應又稱遲發(fā)型變態(tài)反應，發(fā)揮其效應細胞有CD4+Th1細胞，CD8+或CD4+CTL，以及一部分巨噬細胞及中性粒細胞等[13]。皮膚遲發(fā)型超敏反應是進行體內(nèi)細胞免疫評價的有效方法，本次試驗結(jié)果顯示皮內(nèi)組和劃痕組兩種接種方式Br-PPD變應原DTH陽轉(zhuǎn)率均為100%，表明兩種方式免疫均能誘導機體產(chǎn)生較強的細胞免疫應答。

為評價兩種免疫方式的保護效果，用羊布氏菌M5弱毒株攻擊，陰性組豚鼠脾臟分離出大量的羊M5布氏活菌，皮內(nèi)組和劃痕組豚鼠脾臟均無羊M5布氏菌存在，表明兩種方式免疫布氏菌活苗均可使豚鼠獲得很強的免疫保護。

綜上所述，通過體液免疫檢測、細胞免疫評價和疫苗免疫保護力實驗3個方面結(jié)果顯示，兩種方式免疫豚鼠獲得免疫效果幾乎相當，說明皮內(nèi)注射接種有希望代替皮上劃痕接種方法，至于能否真正取代傳統(tǒng)接種方法，還有待強毒布魯氏菌攻擊保護試驗和臨床試驗進一步研究。

參考文獻：

[1]Jin NY, Hu ZM, Feng SZ, et al. New zoonoses[M]. Beijing: Science Press, 2007: 493-512. (in Chinese)

金寧一,胡仲明,馮書章,等.新編人獸共患病學[M].北京:科學出版社,2007:493-512.

[2]Zhao K, Zhang YH, Li HM, et al. Medical biology[M]. 2nded. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2007: 641-650. (in Chinese)

趙鎧,章以浩,李河民,等.醫(yī)學生物制品學[M]. 2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007：641-650.

[3]Boschiroli ML, Foulongne V, O’Callaghan D. Brucellosis: a worldwide zoonosis[J]. Curr Opin Microbiol, 2001, 4(1): 58-64. DOI: 10.1164/rccm.200607-923ED

[4]Pappas G, Papadimitriou P, Akritidis N, et al. The new global map of human brucellosis[J]. Lancet Infect Dis, 2006, 6(2): 91-99. DOI:10.1083/jcb.200811079

[5]Ficht T. Brucella taxonomy and evolution[J]. Future Microbiol, 2010, 5(6): 859-866. DOI: 10.2217/fmb.10.52

[6]Yu H, Chen MJ, Wang JY, et al. Research progress of antiviral vaccines ofBrucellaantigen and immune protection[J]. Guangdong Agr Sci, 2011,24,102-104. (in Chinese)

玉花,陳敏潔,王晶妍,等.布魯氏菌免疫保護抗原與抗病疫苗的研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011,24,102-104.

[7]Guo ZL. Scientific application of animal vaccination method[J]. Anim Husb Vet Sci Technol Inform, 2010, 10: 5-11. (in Chinese)

郭昭林.動物接種疫苗方法的科學應用[[J].城市畜牧獸醫(yī)科技信息,2010,10:5-11.

[8]Ye JL, Deng AG, Li QC. Introduce several common vaccination method[J]. Anim Husb, 2005(10)：40 (in Chinese)

葉敬禮,鄧愛國,李崎川.介紹幾種常用疫苗接種方法[J].畜牧業(yè),2005(10):40.

[9]Liu JF, Li KM, She FF, et al. XTT (Tetrazolium salt) assay for rapid determination of viable count ofBrucellavaccine[J]. Chin J Ctrl Endem Dis, 2011,26(2):103-106. (in Chinese)

劉景福,李恪梅,佘菲菲,等. XTT(四唑鎓鹽)法快速檢測布氏菌疫苗活菌含量的建立[J]. 中國地方病防治雜志, 2011,26(2):103-106.

[10]Pan SW, Chen SQ. Study ofBrucellavaccine approaches[J]. J Microbiol, 1958, 6(1): 79-81. (in Chinese)

潘紹武,陳世祺.布氏桿菌死菌疫苗免疫途徑的研究[J].微生物報,1958,6(1):79-81.

[11]Li KM, Wang GZ, Huang J, et al. Study and preparation of the brucellin purified protein derivative[J]. Chin J Ctrl Endem Dis, 1995, 10(5): 268. (in Chinese)

李恪梅,王國治,黃健,等.布氏菌素純蛋白衍生物的研制[J].中國地方病防治雜志,1995,10(5):268.

[12]Zhao ZP. Identification of virulence associated and immunogenic candidate protein ofBrucellamelitensisfor vaccine development[D]. Beijing: China Academy of Military Medical Science, 2008. (in Chinese)

趙忠鵬 .布魯氏菌毒力、免疫相關(guān)分子的篩選研究[D].北京: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2008.

[13]Gong FL. Medical immunology[M]. 3rd ed. Beijing: Science Press, 2009: 63-71.