關陽，王國良，張國峰，賈力耕，梁穎超，吳延東

（玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春130033）

γ－聚谷氨酸（γ－PGA）是一種聚陰離子多肽，它是由多個谷氨酸單體以γ－羧基和α－氨基經(jīng)肽鍵的形式縮合而成，且每一個谷氨?；及髯缘氖中灾行?。γ－PGA自發(fā)現(xiàn)以來就已然成為現(xiàn)代生物高分子聚合物的研究熱點。有關γ－PGA的純化和測定方法比較成熟，這為開展基因工程和生物化學等方面的研究提供了便利條件[1]。從立體構(gòu)型的角度來分析，γ－PGA具有3種不同類型：γ－D－聚谷氨酸（γ－D－PGA）、γ－L－聚谷氨酸（γ－L－PGA）以及 γ－D/L－聚谷氨酸（γ－DL－PGA）。

在γ－PGA開始實際應用之前，需解決一系列的問題。首先是成本問題，尤其是在現(xiàn)有條件下γ－PGA的成本遠遠高于其它材料。其次，截至目前還不能利用有機化學方法人工合成γ－PGA。此外，還需闡明γ－PGA的生物合成機制，進而為隨后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。如今，我們國家正致力于構(gòu)建和諧社會，發(fā)展生態(tài)經(jīng)濟，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，而“白色生物技術”功不可沒，這為γ－PGA的發(fā)展提供了強大的推動力。

1 理化性質(zhì)

γ－PGA具有良好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性、吸水性以及可生物降解性等，因而具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、助溶、緩釋和粘結(jié)等功能[2]。γ－PGA的pKa=2.23，這與谷氨酸α－羧基的pKa值非常接近[3]。通過熱重（TGA）和差示掃描量熱（DSC）分析可知，其熔點為223.5℃，熱分解溫度為235.9℃[4]。

γ－PGA 可溶于二甲基亞砜（DMSO）、熱的 N，N－二甲基甲酰胺（MSDS）、N－甲基－2－吡咯烷酮（NMP）[5]。分子量和多分散性是γ－PGA的重要特征參數(shù)，γ－PGA的聚合度在200～700之間，分子量分散性為2～5，分子量越大，其流變性越難控制，也越難被化學修飾，從而限制其應用?？刹捎枚喾N方法得到不同分子量的γ－PGA，如超聲波降解[6]、堿水解、微生物或酶降解[7]以及改變培養(yǎng)基成分[8]等。

γ-PGA易溶于水，能夠形成有粘彈性的弱凝膠，但有些物理或化學手段會破壞γ-PGA形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，甚至失去粘彈性，如長時間高溫加熱、酸或堿處理、金屬離子等。研究表明，γ-PGA溶液屬于非牛頓型（假塑性）流體，其表觀粘度隨剪切速率的升高而降低[9]。此外，γ-PGA平均分子量的倒數(shù)與水解時間在80、100℃和120℃下呈線性關系，說明在加熱條件下，水溶液中的γ-PGA多肽鏈可隨機斷裂而發(fā)生水解[10]。

2 應用

γ-PGA的3種構(gòu)型均安全無毒、可食用、可生物降解，很有潛力發(fā)展成為一種環(huán)境友好型高分子材料[11]。交聯(lián)γ-PGA具有很強的持水力，可以代替非降解型水凝膠成為新一代可降解水凝膠[12]。γ-PGA在環(huán)境、農(nóng)業(yè)及生物醫(yī)藥領域都有應用價值，包括生物可降解尿片、蓄水劑、藥物或肥料的緩釋劑等。其中，γ-PGA作為絮凝劑可用于污水處理以及食品和發(fā)酵工業(yè)的下游加工[13]。此外，γ-PGA在工業(yè)中的應用領域急劇擴大，可作為金屬/放射性核素交聯(lián)劑[11]、蛋白酶抑制劑、低溫防護劑[14]、苦味減緩劑[15]、增稠劑、飼料添加劑、骨質(zhì)疏松預防因子[16]、濕潤劑、藥物載體[17]、基因載體[18]、治療性生物粘合劑[19]、分散劑和抗體/酶結(jié)合（固定）材料[20]。

3 生產(chǎn)菌株

自發(fā)現(xiàn)第一株生產(chǎn)菌Bacillus anthracis后，又相繼發(fā)現(xiàn)古生菌、細菌和動物均能產(chǎn)生γ-PGA。

3.1 聚-γ-DL-谷氨酸產(chǎn)生菌

1913年，從日本納豆中分離出一株枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。在后續(xù)研究中，在納豆粘液中發(fā)現(xiàn)了γ-DL-PGA[21]。

產(chǎn)γ-DL-PGA的芽孢桿菌可分為自產(chǎn)谷氨酸型和外源谷氨酸依賴型。B.subtilis 5E[15]、B.subtilis TAM-4[22]、B.licheniformis A35[23]和 B.licheniformis S173[24]等屬于前者。B.subtilis IFO 3335[25]、B.subtilis subsp.Chungkookjang[21]、B.licheniformis WBL-3[26]、B.licheniformis P-104[27]等屬于后者。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的γ-PGA具有立體結(jié)構(gòu)多樣性[28]，很可能具有兩種或兩種以上γ-PGA合成體系。除枯草芽孢桿菌外，Staphylococcus epidermidis的某些菌株也可以產(chǎn)生γ-DL-PGA以避免激發(fā)哺乳動物的免疫反應[29]。

3.2 聚-γ-D-谷氨酸產(chǎn)生菌

20世紀50年代，僅發(fā)現(xiàn)B.anthracis可以生產(chǎn)γ-D-PGA[30]。雖說γ-D-PGA對哺乳動物無毒害作用，但是它可以減弱宿主的免疫力甚至加重炭疽熱癥狀[31]。

3.3 聚-γ-L-谷氨酸產(chǎn)生菌

從很多極端微生物體中分離得到γ-L-PGA[11]。極端嗜堿菌Bacillus halodurans[32]和 Natronococcus Occultus[33]分泌的低分子量γ-L-PGA可以中和菌體周圍的堿性環(huán)境，而極端嗜鹽古生菌Natrialba aegyptiaca產(chǎn)生的高分子量γ-L-PGA可以在高鹽環(huán)境中防止菌體脫水[34]。有研究表明，Bacillus megaterium在鹽的誘導下可以產(chǎn)生以L型為主的γ-PGA[35]。此外，γ-L-PGA還廣泛分布于多種刺胞生物中，比如水螅中刺細胞分泌粘液的主要成分就是γ-L-PGA[36]。在產(chǎn)生γ-L-PGA的過程中，具有生物活性的陽離子如K+、Mg2+和Ca2+可以輔助調(diào)節(jié)生物體內(nèi)滲透壓。

4 氨基酸多聚物的非核糖體聚合模式

抗菌多肽和抗菌聚氨基酸一般具有以下特點：含有非蛋白質(zhì)氨基酸（如γ-PGA中的D-谷氨酸殘基）、鍵合獨特（如γ-PGA中的γ-氨基參與成鍵）且修飾方式與眾不同。他們通常都是非核糖體合成模式。

4.1 γ-PGA的硫模板合成機制

有研究發(fā)現(xiàn)，從L-谷氨酸合成γ-D-PGA的過程中需要細胞膜的輔助；反之，D-谷氨酸既不能作為底物也不充當抑制劑。這種核苷由副反應產(chǎn)生，比如L-谷氨酸存在下，ATP水解成AMP[37]。

以上發(fā)現(xiàn)有力地支持了γ-PGA的硫模板機制假說，尤其更適用于γ-D-PGA。酶中的兩個巰基基團可參與催化：結(jié)合位點S1H和延伸位點S2H。首先，L-谷氨酸活化，ATP水解生成L-谷氨酰-γ-腺苷酸；然后以共價鍵形式連接到S1H基團上，異構(gòu)成D-谷氨酸。γ-D-PGA鏈和S2H基團的硫酯鍵受到S1H位點上的D-谷氨酰的親核攻擊，進而使鏈得到延伸。最后，γ-DPGA鏈重新回到S2H位點或被終止子釋放從而反應結(jié)束。雖然，B.licheniformis的基因組已被破解，但類似非核糖體肽合成酶（NRPS）的γ-PGA合成酶基因圖譜尚不清楚。而一旦被獲悉，人們將很可能發(fā)現(xiàn)一種全新的合成生物多聚氨基酸分子機制及其嚴格的立體結(jié)構(gòu)規(guī)則。

4.2 γ-PGA的氨基連接合成機制

在B.subtilis subsp.chungkookjang中發(fā)現(xiàn)，合成γ-PGA需要細胞膜的輔助[38]。與 B.licheniformis ATCC9945不同，它可以同時利用D-和L-谷氨酸作為底物；而且，ATP水解后得到的是ADP而非AMP[39]。有學者研究表明，B.subtilis中的γ-DL-PGA合成酶不是類似NRPS，而是一種內(nèi)含氨基連接酶的模塊蛋白復合體[40]。有趣的是，B.anthracis 合成 γ-D-PGA[41]、B.licheniformis合成 γ-DL-PGA[42]、S.epidermidis合成 γ-DL-PGA[29]的酶均與B.subtilis中PGA合成酶的一級結(jié)構(gòu)相類似。

上述發(fā)現(xiàn)均與氨基連接機制假說相一致。該假說中，在任何反應階段γ-PGA都不以共價鍵的方式與細胞膜輔助的酶相連接；因此，必須有一步與胞壁質(zhì)的粘合反應[43]。首先，ATP中的磷?；D(zhuǎn)移到γ-PGA鏈末端的羧基上，處于活性位點的ADP得以釋放。然后D-/L-谷氨酸單體對γ-PGA的磷酸化羧基進行親核攻擊，進而形成一個新氨基連接。該反應在酶活性位點上重復進行，γ-PGA鏈便得以延伸。在解釋芽孢桿菌分泌的γ-PGA為何分子量差異較大且立體結(jié)構(gòu)多樣性時，氨基連接機制似乎比硫模板機制更加合理。

5 生物法合成γ-PGA的前體

毫無疑問，谷氨酸是γ-PGA的直接前體，但D-谷氨酸是否可以成為γ-D-和γ-DL-PGA的底物？正因為如此，才會出現(xiàn)兩種截然不同的γ-PGA合成機制假說。一項關于合成含有D-谷氨酸微囊藻毒素的NRPS研究中發(fā)現(xiàn)，由谷氨酸消旋酶生成的D-谷氨酸可以直接進入相應的氨基酸殘基位點[44]。但在硫模板機制中，L-到D-的單向異構(gòu)作用是不存在的。

5.1 L-谷氨酸的生物合成

在B.subtilis中，合成代謝和分解代謝均可生成L-谷氨酸。一般而言，一個L-谷氨酸分子和一個α-酮戊二酸分子在L-谷氨酰胺合成酶和L-谷氨酸合酶的催化下得到兩分子L-谷氨酸[45]。谷氨酸鹽缺乏時，α-酮戊二酸和NH4+經(jīng)L-谷氨酸脫氫酶催化生成L-谷氨酸。而L-天冬氨酸和α-酮戊二酸經(jīng)L-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶生成草酰乙酸和L-谷氨酸。此外，谷氨酸族的外源氨基酸，如L-精氨酸和L-脯氨酸均可異化生成L-谷氨酸[15]。很可能是因為胞內(nèi)過量的L-谷氨酸誘導合成γ-PGA。通過分析B.subtilis中的外源L-谷氨酸，有助于闡明外源L-谷氨酸依賴型γ-PGA的合成機制。

5.2 D-谷氨酸的生物合成

研究芽孢桿菌中D-谷氨酸的合成時，D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（DAT）和谷氨酸消旋酶（GLR）是非常重要的兩種酶。除此之外，人們更關注兩種酶活性之間的關系和γ-PGA的立體結(jié)構(gòu)。一般而言，完全D-或優(yōu)先合成D-的 γ-PGA 產(chǎn)生菌（B.anthracis和 B.licheniformis），其DAT活性較高；γ-DL-PGA產(chǎn)生菌（B.subtilis）具有GLR活性；完全L-或優(yōu)先合成L-的γ-PGA產(chǎn)生菌（B.megaterium和N.aegyptiaca），其D-谷氨酸合成相關酶的活性較低或不存在[47]。

6 γ-PGA合成酶

若合成的γ-PGA分泌至胞外（分泌型），則相關基因命名為 pgs（Polyglutamate synthase）；若作為莢膜成分（結(jié)構(gòu)型），其相關基因命名為 cap（Capsule）[48]。

6.1 分泌型γ-PGA合成酶

Ashiuchi等人對一株野生型B.subtilis染色體DNA中合成γ-DL-PGA的基因簇進行了鑒定，這個基因簇包含四個開放閱讀框（ORF），即 pgsB、pgsC、pgsA（或 pgsAA）和 pgsE[38]。

B.subtilis中的 γ-PGA 合成酶（PgsB，Pgs-C，Pgs-A，和Pgs-E）均位于膜上，但是Pgs組分的特點是含有一些可溶解的形式。有人發(fā)現(xiàn)PgsB只有在L-谷氨酸存在時才會催化ATP水解，而溶解的PgsBC和PgsBCA可以在D-/L-谷氨酸存在時水解ATP。到目前為止，已鑒定出來的所有水溶性的Pgs組分都不是γ-PGA合成酶。它們僅僅是依賴谷氨酸的ATP水解酶或者是特有的酰胺連接酶，可能會合成非常短的γ-谷氨酰基肽段。目前，只有一種位于細胞膜的γ-PGA合成酶能催化合成高分子量的γ-PGA。

為了進一步了解γ-PGA生物合成的分子機制，應該對γ-PGA合成酶的結(jié)構(gòu)生物學進行研究。下面總結(jié)了每種Pgs組分的結(jié)構(gòu)特點和預測的功能。

通常認為PgsB是發(fā)揮催化作用的最主要組分[49]，因為它的一級結(jié)構(gòu)跟那些依賴Mg/ATP的水溶性的酰胺連接酶相類似，而酰胺連接酶可以催化短的γ-L-谷?；溞纬梢粋€葉酸基[50]。

PgsC很有可能是這種酶嵌入膜內(nèi)的一種組分[11]。PgsC與N-乙酰谷氨酸合成酶的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶域結(jié)構(gòu)域相似[51]。而ε-聚-L-賴氨酸合成酶在C-末端也有類似于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的三個串聯(lián)重復單元，并且所有重復單元在催化過程中都發(fā)揮著重要的作用[52]。

PgsA有膜錨定區(qū)域[11]，可以使酶固定在細胞表面[53]，在很多微生物中都可以找到類似的組分。B.subtilis中的PgsA可能在γ-PGA分泌和（或）含有D-谷氨酸的γ-PGA合成酶的翻譯后修飾中發(fā)揮重要作用。

與Pgs的其他組分相比，PgsE的作用還不完全清楚。不過有研究結(jié)果顯示，它可能和一種膜相關的CapE（γ-PGA合成酶結(jié)構(gòu)型）在功能上相同，這種CapE在B.anthracis中以質(zhì)粒為負載的γ-PGA合成體系內(nèi)是一種主要成分[43]。

6.2 結(jié)構(gòu)型γ-PGA合成酶

B.anthracis的莢膜中含有γ-D-PGA，其為該病原菌毒性的主要成分之一[31]。B.anthracis中包含兩個質(zhì)粒 pXO1（108 kb）和 pXO2（951 kb）。研究表明，在質(zhì)粒pXO2上鑒定出基因簇狀的三個ORF，即capB、capC和capA；它們對消除了質(zhì)粒pXO2的B.anthracis突變體的莢膜恢復至關重要，并推斷γ-D-PGA的合成體系是一位于膜上的多酶復合體[54]。將capBCA克隆到Escherichia coli中，表達后發(fā)現(xiàn)capB為重疊基因，它能夠編碼兩種蛋白CapB和CapB′，CapBCA以膜結(jié)合蛋白形式存在；另外，在capBCA基因簇下游發(fā)現(xiàn)了編碼γ-D-PGA降解酶的基因dep[46]。

7 結(jié)論與展望

自從γ-PGA發(fā)現(xiàn)以來已有整整一百年了。盡管現(xiàn)代遺傳學的發(fā)展有助于闡明γ-PGA的產(chǎn)生機制，但是酶學研究仍然處于初期階段。鑒于一些帶有γ-L-/γ-D-谷氨酰胺殘基相對較小的化合物是通過酰胺連接形成的，因此可以推測γ-PGA也是通過同樣的途徑合成的；另一方面，鏈延伸的過程在γ-PGA的合成中并不多見，仍需進一步闡明γ-PGA生物合成的分子機制。γ-PGA合成酶的膜關聯(lián)性是否對鏈的延伸起著關鍵作用還有待研究。

塑料和水凝膠因其便利性和經(jīng)濟性逐漸成為一種現(xiàn)代工業(yè)和日常生活中的必需品，而絕大多數(shù)都來自于石油化工產(chǎn)品。但是不合理的利用會對環(huán)境和健康帶來負面影響。因此，當今社會亟需環(huán)境友好型生物可降解大分子材料，從而有助于節(jié)約資源和能源、抑制溫室效應、提高糧食產(chǎn)量、實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。γ-PGA正是這樣一種順應潮流的生物高分子材料，希望γ-PGA合成機制的闡明可以幫助確立一個有效的γ-PGA生產(chǎn)體系，進而被以γ-PGA為原材料的制造業(yè)所采用，來生產(chǎn)適合未來生活方式的生態(tài)材料。

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