冀 航 王肅生 張志華 梁 剛

（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510120）

青蒿琥酯抑制人成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

冀 航 王肅生 張志華 梁 剛

（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510120）

目的探討青蒿琥酯（Art）抑制人成纖維細(xì)胞（Fb）增殖的作用及機(jī)制。方法取人瘢痕組織，經(jīng)體外培養(yǎng)及鑒定Fb后，將不同濃度的青蒿琥酯溶液作用于體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。于倒置顯微鏡及電鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化，采用四氮唑鹽比色分析法（MTT法）及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡，計(jì)算增殖抑制率和凋亡指數(shù)。結(jié)果青蒿琥酯對人瘢痕成纖維有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。濃度為240、120 mg/L的青蒿琥酯的凋亡率和壞死率較對照組高（Ρ＜0.01）。組織學(xué)觀察試驗(yàn)組見成纖維細(xì)胞呈橢圓性，胞質(zhì)顆粒增多，甚至可見細(xì)胞核濃縮、核碎裂等現(xiàn)象。結(jié)論 青蒿琥酯可抑制人成纖維細(xì)胞的增殖，具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

青蒿琥酯；成纖維細(xì)胞；凋亡；瘢痕

本實(shí)驗(yàn)研究青蒿琥酯對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響，為 青蒿琥酯在瘢痕治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 由廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供的整形外科手術(shù)切除的皮膚瘢痕中選取組織標(biāo)本作為細(xì)胞來源。選用的皮膚來源需要在近期無使用瘢痕抑制藥物的情況并且沒有其他系統(tǒng)性疾病，取自愿捐獻(xiàn)的人耳垂增生性瘢痕。

1.2 主要試劑和儀器：青蒿琥酯（純度99.99%，廣西桂林第二制藥廠）。四氮唑溴鹽MTT（Sigma公司，美國）；RΡMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）；胰蛋白酶由Gibco公司提供；二甲基亞砜由Sigma公司提供；兔抗人第八因子相關(guān)抗原多克隆抗體、鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、羊抗兔IgG以及生物素化羊抗鼠IgG由武漢市博士德公司提供；凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、LΡropidium Iodide（Omega公司，美國）。ELX800型酶標(biāo)儀（寶特公司，美國）；由德國WTBBinder公司提供CO2培養(yǎng)箱，由德國Leica公司提高倒置顯微鏡；由日本Jeol公司提供透射電鏡；由美國Coulter公司提供流式細(xì)胞儀。

1.3 體外培養(yǎng)和鑒定成纖維細(xì)胞：在無菌條件下將手術(shù)切除的瘢痕組織后放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有鏈霉素450 mg/L，在12 h內(nèi)取出標(biāo)本，取出步驟在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。用手術(shù)刀片和剪刀祛除表皮和基底層，裁剪經(jīng)過清潔的瘢痕組織，組織塊的大小為2 mm×2 mm ×2 mm，需要在無菌條件下完成。選用50 mL培養(yǎng)瓶放置組織塊，將組織塊均勻地黏附于瓶壁上，保持兩兩之間間距在1～1.5 cm左右。隨后在瓶內(nèi)加入RΡMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液含有10%胎牛血清，培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境保持在37 ℃以及5%CO2，在融合70%～80%后傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)到至第4～5代進(jìn)行?？共ㄐ蔚鞍卓贵w免疫細(xì)胞化學(xué)SΡ法染色，光鏡下觀察培養(yǎng)獲得的細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞。

1.4 倒置顯微鏡觀察：選取第4～5代中生長情況較好的成纖維細(xì)胞，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，將所有細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞濃度改為60、120、180 mg/L的青蒿琥酯培養(yǎng)液各5 mL，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；對照組只加入等量的培養(yǎng)液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)48 h后將細(xì)胞固定，HE染色，觀察并拍攝形態(tài)學(xué)改變采用倒置顯微鏡的方法。

1.5 MTT法檢測青蒿琥酯對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響：取第4～5代生長良好的成纖維細(xì)胞，在96孔板加入細(xì)胞100 μL/孔（約1× 104），置37 ℃，5%CO2，飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為60、120和180 mg/L的青蒿琥酯培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組。每孔加50 μL MTT，在37 ℃孵育4 h，祛除上清液，搖勻。酶標(biāo)儀在550 nm波長處測定每孔的光密度，即OD值。計(jì)算青蒿琥酯對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制率，生長抑制率=（1-用藥組OD/對照組OD）×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡情況采用流式細(xì)胞儀檢測：取第4～5代生長良好的成纖維細(xì)胞，在6孔塑料培養(yǎng)板中以2×105個(gè)/孔的密度接種，進(jìn)行1 d的常規(guī)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞壁的生長情況，之后用濃度為60、120和180 mg/L青蒿琥酯培養(yǎng)液分別作用于細(xì)胞，選取碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組作為參照，繼續(xù)1 d培養(yǎng)，0.25%胰酶消化貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞用ΡBS洗滌2次，制備受試樣品細(xì)胞懸液，加入2 μL Annexin V-FITC及 5 μL Ρropidium Iodide后混勻，避光室溫反應(yīng)5 min后上流式細(xì)胞儀，Ex=488 nm；Em=530 nm檢測細(xì)胞凋亡和壞死情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SΡSS11.0軟件，用中位數(shù)來描述統(tǒng)計(jì)，多組數(shù)據(jù)之間的對比以方差分析的方式進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 人增生性瘢痕痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

經(jīng)過倒置顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，HE染色的成纖維細(xì)胞的形狀典型的長梭形或不規(guī)則形貼壁細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)很豐富，顏色呈淡紫色，胞核大，顏色呈藍(lán)色，位于細(xì)胞中央，呈放射狀排列。抗波形蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)SΡ法染色顯示培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞胞質(zhì)對波形蛋白表達(dá)陽性，第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性，提示培養(yǎng)所得細(xì)胞為間葉組織來源，符合成纖維細(xì)胞特性。

2.2 倒置顯微鏡觀察

在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞貼壁，可發(fā)現(xiàn)對照組的生長較好，另外其增殖也處于良好狀態(tài)，觀其形態(tài)可發(fā)現(xiàn)屬于梭形，排列形狀為放射狀，另觀察其細(xì)胞的表面，可看到突起呈細(xì)長狀。隨青蒿琥酯濃度增加（120和180 mg/L），細(xì)胞排列明顯紊亂，細(xì)胞由梭形變成橢圓性，突起減少，胞質(zhì)較多顆粒，胞核深染，可見凋亡小體。180 mg/L組于16 h后即可觀察到上述形態(tài)改變，隨時(shí)間延長，發(fā)生改變的細(xì)胞比例增多。

2.3 MTT法檢測結(jié)果見表1。

表1 青蒿琥酯對成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.4 流式細(xì)胞儀檢測

青蒿琥酯鈉對成纖維細(xì)胞作用，通過流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果，見表2。

表2 流式細(xì)胞儀檢測青蒿琥酯對成纖維細(xì)胞的抑制作用

3 討 論

作為一種皮膚纖維化疾病，增生性瘢痕是在創(chuàng)傷愈合過程中形成的，其病理上表現(xiàn)觀察比較方便，觀察是否有過多無序沉積的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，膠原形成細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞，增生性瘢痕形成的主要原因是成纖維細(xì)胞活化、增殖及其膠原代謝的異常[1,2]。

本文研究中選取青蒿琥酯作用于體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察并分析了青蒿琥酯在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活力方面的作用。根據(jù)本文研究結(jié)果，青蒿琥酯在抑制增生瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖上有一定作用，抑制方式上具有劑量和時(shí)間依賴性，說明青蒿素防治瘢痕的機(jī)制之一是能夠抑制人瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖、分化以及膠原合成，可以作為臨床應(yīng)用的理論依據(jù)[3]。

綜合本實(shí)驗(yàn)的研究，提示青蒿琥酯可呈劑量依賴性抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制是青蒿琥酯可能通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡而抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，但青蒿琥酯通過何種機(jī)制誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，是否有凋亡相關(guān)蛋白水平的變化，在這方面需要做進(jìn)一步的研究。

[1] 青蒿素結(jié)構(gòu)研究協(xié)作組.一種新型的倍半萜內(nèi)酯— —青蒿素[J].科學(xué)通報(bào),1977,22(3):142.

[2] 賀光照,黃崇本,張代錄,等.青蒿素局部治療增殖性瘢痕臨床觀測[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,23(3):260-262.

[3] 曹治東,石崇榮,黃崇本,等.青蒿素對體外瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2003,32(5):521-523.

Artesunate Inhibits Experimental Study on Fibroblast Proliferation

YI Hang, WANG Su-sheng, ZHANG Zhi-hua, LIANG Gang
(Department of Plastic Surgery, The Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveInvestigate the effects of artesunate(Art) inhibit fibroblast(Fb) proliferation effect and mechanism.MethodThe scar tissues, And the identification of in vitro Fb, The effect of artesunate fibroblast solution of different concentrations in vitro. In the inverted microscope and electron microscope observation of the morphological changes, With MTT colorimetric analysis method (MTT method) and flow cytometry were used to observe the apoptosis, Calculation of inhibition rate and apoptosis index.ResultArtesunate fiber has obvious inhibitory effects on human scar, in a dose-dependent manner. Concentration of 240, 120 mg/L of artesunate apoptosis rate and necrosis rate than the control group (Ρ＜0.01). Histological observation test group see fibroblasts were elliptic, cytoplasmic granules increased, or even visible nuclear condensation, nuclear fragmentation phenomenon.ConclusionArtesunate could inhibit the proliferation of fibroblasts, the specific mechanism needs further study.

Artesunate; Fibroblast; Apoptosis; Scar

R285；R563.9

B

1671-8194（2014）10-0002-02

廣州市衛(wèi)生科技項(xiàng)目資助（2006-YB-156）； 廣州市教育局科技項(xiàng)目資助（61075）