王嘉+覃尚珠+曾常茜+等

王 嘉1 覃尚珠2 曾常茜2 李 坤2 丁 寧2

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧大連 116600

[摘要] 目的 探討雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4（AQP4）表達(dá)的影響。 方法 30只SD大鼠隨機分成三組：對照組、海人酸組、雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組，每組10只。海人酸組頸內(nèi)皮下注射海人酸，劑量為10 mg/kg；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組在海人酸注射前連續(xù)7 d腹腔內(nèi)注射雷公藤內(nèi)酯，劑量為30 μg/kg；對照組注射等量的生理鹽水。造模成功后取腦海馬組織，應(yīng)用RT-PCR和Western blot法檢測各組動物海馬區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)。 結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，海人酸組和對照組AQP4條帶與GAPDH條帶的灰度值比分別為0.872±0.141和0.453±0.078，海人酸組AQP4表達(dá)顯著增多（P < 0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組中海馬AQP4蛋白相對灰度值比為0.647±0.185，表達(dá)較海人酸組減少（P < 0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，海人酸組與對照組AQP4條帶與GAPDH條帶的灰度值比分別為1.212±0.115和0.843±0.091，海人酸組AQP4 mRNA表達(dá)比對照組顯著增加（P < 0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組AQP4 mRNA相對灰度值比為1.105±0.192，與海人酸組比較明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠腦海馬區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)有下調(diào)作用，可以作為臨床難治性癲癇的候選藥物之一。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤內(nèi)酯；海人酸；難治性癲癇；水通道蛋白4

[中圖分類號] R742.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（c）-0009-04

Effect of triptolide on the expression of AQP4 protein in hippocampus of kainite-induced epilepsia rat

WANG Jia1 QIN Shangzhu2 ZENG Changqian2 LI Kun2 DING Ning2

1.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Province， Dalian 116011， China； 2.Department of Biochemistry， Medical College of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116600， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of triptolide on the expression of AQP4 protein in hippocampus of kainite-induced epilepsia rat. Methods 30 SD rats were divided into 3 groups， each group had 10 rats， including control group， kainite-induced group and triptolide treatment group. Kainite-induced group was endothelial injected with kainic acid of 10 mg/kg. Triptolide treatment group was intraperitoneal injected with triptolide of 30 μg/kg before kainic acid injection for 7 consecutive days. Control group was injected with normal saline. Hippocampus was taken from brain after establishing the model successfully. Western blot and RT-PCR were used to examine the expression of AQP4 protein in the hippocampus of rats. Results Western blot results showed that the expression ratio of AQP4 and GAPDH in the hippocampal region of kainite-induced group was 0.872±0.141，which increased significantly than control group （0.453±0.078， P < 0.05）. The expressions ratio of AQP4 and GAPDH in the hippocampal region of triptolide treatment group was 0.647±0.185， which obviously decreased than kainite-induced group （P < 0.05）. RT-PCR results showed that the expression ratio of AQP4 and GAPDH in the hippocampal region of kainite-induced group was 1.212±0.115，which increased significantly than control group （0.843±0.091， P < 0.05）. The expressions ratio of AQP4 and GAPDH in the hippocampal region of triptolide treatment group was 1.105±0.192， which obviously decreased than kainite-induced group （P < 0.05）. Conclusion Triptolide can inhibit the expression level of AQP4 protein in the hippocampal region in epilepsy rats and play a important role in the drug therapy.

[Key words] Triptolide； Kainite； Intractable epilepsy； AQP4

癲癇是常見的腦部慢性疾病，以大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致的短暫大腦功能障礙為特征。在我國有20%～25%的癲癇患者常規(guī)藥物治療得不到有效控制，成為社會家庭的沉重負(fù)擔(dān)。雷公藤內(nèi)酯是近來神經(jīng)退行性疾病臨床治療研究的熱點藥物之一，對老年性癡呆（Alzheimer's disease，AD）、帕金森?。≒arkinson diease，PD）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等具有神經(jīng)保護作用[1]。雷公藤內(nèi)酯對于癲癇的治療研究也取得了一定的進展[2-3]。目前在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白（AQPs），其中水通道蛋白4（AQP4）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，與癲癇發(fā)病的電生理學(xué)機制、癲癇持續(xù)狀態(tài)及難治性癲癇腦損傷等機制密切相關(guān)[4]。本實驗觀察了雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠腦海馬AQP4蛋白表達(dá)的影響，為雷公藤內(nèi)酯應(yīng)用于臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

10周齡SD雄性大鼠30只，體重（230±10）g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。免抗AQP4多克隆抗體購自Santa Cruz Technology公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋公司；RIPA蛋白裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白定量及ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物公司；Trizol及RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；雷公藤內(nèi)酯購自北京優(yōu)尼康公司；海人酸購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及藥物注射 SD大鼠分成三組：對照組、海人酸組、雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組，各10只。稱取記錄大鼠重量后，海人酸組頸內(nèi)皮下注射海人酸，劑量為10 mg/kg；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組在海人酸注射前連續(xù)7 d腹腔內(nèi)注射雷公藤內(nèi)酯，劑量為30 μg/kg；對照組注射等量的生理鹽水。造模后觀察動物的行為變化。

1.2.2 海馬組織取材及保存 致癇后第1天取腦海馬組織，10%水合氯醛（350 mg/kg）皮下深麻醉后，在冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中取出全腦，由矢狀線切開，去除小腦及間腦，沿穹隆分離側(cè)腦室，去除外側(cè)壁的腦組織，將海馬從剩余腦組織上剝離，包于干凈錫紙中，標(biāo)記后快速投入液氮中浸透，各組標(biāo)本收集齊后從液氮轉(zhuǎn)到-70℃低溫冰箱凍存。

1.2.3 Western blot法檢測AQP4蛋白表達(dá) 取材方法同“1.2.2”項下，準(zhǔn)備好冰盒將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預(yù)冷勻漿器中，勻漿的同時加入RIPA蛋白裂解液（含PMSF100 μmol/L），然后12 000 r/min離心15 min除沉淀，BCA蛋白定量后分裝凍存。各泳道取60 μg樣品上樣后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。5% BSA中4℃過夜封閉后用一抗（免抗AQP4多克隆抗體1∶400，兔抗GAPDH單抗1∶400）孵育2.5 h。而后TBST清洗3次，每次10 min。繼之以HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG抗體1∶1000 稀釋）37℃孵育1 h后TBST清洗5次，每次10 min。最后于暗室ECL發(fā)光經(jīng)顯影、定影后檢測目的條帶。膠片掃描后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.4 RT-PCR法檢測AQP4基因表達(dá) 取材方法同“1.2.2”項下，將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預(yù)冷勻漿器中，加入1 mL Trizol勻漿至肉眼看不見組織顆粒，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加200 μL氯仿/異戊醇（24∶1）劇烈振蕩，混勻30 s，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清300～400 μL加等體積異丙醇，冰上放置5 min后4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀加75%乙醇1 mL，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀干燥。加20 μL DEPC水溶解。紫外分光光度計測A260和A280并計算濃度。將1 μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)條件為42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min；1個循環(huán)后用AQP4上游引物5′-GTCCTCATCTCCCTTTGCTTT-3′，下游引物5′-GACTCCCAATCCTCCAACCAC-3′。管家基因GAPDH上游引物5′-TCCCACTCTTCCACCTTC-3′，下游引物5′-CTGTAGCCGTATTCATTGTC-3′分別進行特異性擴增，反應(yīng)條件優(yōu)化為 94℃ 2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min，1個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測表達(dá)量的變化。凝膠成像儀照相并用Quantity One軟件分析測定灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SSPS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物海馬區(qū)AQP4蛋白表達(dá)水平變化

Western blot結(jié)果顯示，海人酸組與對照組AQP4條帶與GAPDH條帶的灰度值比分別為0.872±0.141和0.453±0.078，海人酸組AQP4表達(dá)顯著增多（P < 0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組中海馬AQP4蛋白相對灰度值比為0.647±0.185，較對照組增多（P < 0.05），較海人酸組AQP4表達(dá)顯著減少（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組動物海馬區(qū)AQP4 mRNA表達(dá)水平變化

RT-PCR結(jié)果顯示，海人酸組與對照組AQP4條帶與GAPDH條帶的灰度值比分別為1.212±0.115和0.843±0.091，海人酸組AQP4 mRNA表達(dá)與對照組比較顯著增加（P < 0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組AQP4 mRNA相對灰度值比為1.105±0.192，與對照組相比，表達(dá)顯著增加（P < 0.05），與海人酸組相比，AQP4 mRNA表達(dá)水平顯著減少（P < 0.05）。見圖2。

1：對照組，2：海人酸組，3：雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組；與對照組比較，

★P < 0.05；與海人酸組比較，☆P < 0.05

圖2 雷公藤內(nèi)酯對大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4 mRNA水平的影響

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病之一，全世界癲癇患者總數(shù)達(dá)3000萬人，且我國每年有45萬新增患者，總數(shù)約650萬[5]，其中約有1/4的患者治療后不能有效控制發(fā)作，轉(zhuǎn)為難治性癲癇；而約有2/3的難治性癲癇為顳葉癲癇。顳葉癲癇的臨床特征是反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)性癲癇發(fā)作，最明顯的病理改變是海馬組織硬化，病情進展迅速，預(yù)后極差。因此積極尋求高效、安全、毒副作用小的抗癇新藥及治療新靶點已成為臨床及基礎(chǔ)研究的重中之重。

雷公藤內(nèi)酯是從雷公藤中分離出來的單體，毒性較小。它可以透過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。大量研究顯示，雷公藤內(nèi)酯可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎癥因子及促炎癥細(xì)胞因子的釋放，對神經(jīng)元具有明確的保護作用[5-6]，但其對水通道蛋白家族作用的分子機制方面研究報道較少。

AQP4是大腦內(nèi)的主要水通道蛋白，在軟腦膜、室管膜、脈絡(luò)叢及海馬、視上核、下丘腦等均有顯著的表達(dá)[7]。AQP4在神經(jīng)系統(tǒng)主要有控制腦內(nèi)水分的流動，易化星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性等作用，參與了腦缺血、顱內(nèi)感染、腦腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)過程。AQP4在癲癇治療中的作用一直是研究熱點，Binder等[8]發(fā)現(xiàn)AQP4敲除可提高癲癇發(fā)作的閾值，提示神經(jīng)膠質(zhì)的AQP4可能參與了腦興奮性活動的調(diào)節(jié)。在對海馬硬化的中央顳葉癲癇患者的研究中發(fā)現(xiàn)，硬化海馬中水含量增多。通過采用定量RT-PCR分析、免疫組織化學(xué)和高通量免疫金標(biāo)記的方法檢測發(fā)現(xiàn)，硬化的海馬中AQP4表達(dá)明顯上調(diào)[9]。腹腔注射鋰-匹羅卡品建立SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，在6、12、24、48、72、96、120、168 h分別用免疫組化和RT-PCR方法檢測AQP4的表達(dá)，結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)24 h后腦組織AQP4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增高，48 h達(dá)到高峰，持續(xù)72 h后下降，并且AQP4的動態(tài)表達(dá)變化和腦水腫形成過程呈正相關(guān)[10]。以上研究說明AQP4與癲癇疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，AQP4很可能成為癲癇治療研究的新靶點。

本實驗采用大鼠皮下注射海人酸方法建立了大鼠癲癇模型，它是研究難治性癲癇發(fā)病機制及藥物治療的良好模型。RT-PCR和Western blot結(jié)果均表明，海人酸組中海馬AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比對照組顯著增多（P < 0.05），與Alvestad等[11]報道一致。進一步用雷公藤內(nèi)酯干預(yù)發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比海人酸組顯著減少（P < 0.05）。結(jié)果提示，雷公藤內(nèi)酯可下調(diào)AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，可以作為臨床治療難治性癲癇的候選藥物之一。但是雷公藤內(nèi)酯對其下調(diào)的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 關(guān)遜.癲癇和發(fā)作性疾病[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2001：221-223.

[2] 趙薇，曹巖，趙彩紅，等.雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用及相關(guān)PUMA蛋白表達(dá)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（5）：443-445.

[3] 楊宜承，趙薇，曾常茜，等.雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠神經(jīng)元caspase3和caspase9蛋白表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（2）：48-50.

[4] 張勇.水通道蛋白4及其在癲癇研究中的進展[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（5）：318-320.

[5] 周海燕.癲癇持續(xù)狀態(tài)對幼年大鼠海馬早期影響及雷公藤甲素保護作用的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2012.

[6] Zhou HF，Liu XY，Niu DB，et al. Triptolide protects dopaminergic neurons from inflammation-mediated damage induced by lipopolysaccharide intranigral injection [J]. Neurobiol Dis，2005，18（3）： 441-449.

[7] Yool AJ. Aquaporins： multiple roles in the central nervous system [J]. Neuroscientist，2007，13（5）：470-485.

[8] Binder DK，Oshio K，Ma T，et al. Increased seizure threshold in mice lacking aquaporin-4 water channels [J]. Neuroreport，2004，15：259-262.

[9] Lee TS，Eid T，Mane S，et al. Aquaporin-4 is increased in the sclerotic hippocampus in human temporal lobe epilepsy [J]. Acta Neuropathoi，2004，108（6）：493-502.

[10] 蒙蘭青，韋世革，黃瑞雅，等.大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后水通道蛋白4的表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（2）：144-147.

[11] Alvestad S，Hammer J，Hoddevik EH，et al. Mislocalization of AQP4 precedes chronic seizures in the kainate model of temporal lobe epilepsy [J]. Epilepsy Res，2013，105（1）：30-41.

（收稿日期：2013-12-11 本文編輯：程 銘）

1：對照組，2：海人酸組，3：雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組；與對照組比較，

★P < 0.05；與海人酸組比較，☆P < 0.05

圖2 雷公藤內(nèi)酯對大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4 mRNA水平的影響

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病之一，全世界癲癇患者總數(shù)達(dá)3000萬人，且我國每年有45萬新增患者，總數(shù)約650萬[5]，其中約有1/4的患者治療后不能有效控制發(fā)作，轉(zhuǎn)為難治性癲癇；而約有2/3的難治性癲癇為顳葉癲癇。顳葉癲癇的臨床特征是反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)性癲癇發(fā)作，最明顯的病理改變是海馬組織硬化，病情進展迅速，預(yù)后極差。因此積極尋求高效、安全、毒副作用小的抗癇新藥及治療新靶點已成為臨床及基礎(chǔ)研究的重中之重。

雷公藤內(nèi)酯是從雷公藤中分離出來的單體，毒性較小。它可以透過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。大量研究顯示，雷公藤內(nèi)酯可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎癥因子及促炎癥細(xì)胞因子的釋放，對神經(jīng)元具有明確的保護作用[5-6]，但其對水通道蛋白家族作用的分子機制方面研究報道較少。

AQP4是大腦內(nèi)的主要水通道蛋白，在軟腦膜、室管膜、脈絡(luò)叢及海馬、視上核、下丘腦等均有顯著的表達(dá)[7]。AQP4在神經(jīng)系統(tǒng)主要有控制腦內(nèi)水分的流動，易化星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性等作用，參與了腦缺血、顱內(nèi)感染、腦腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)過程。AQP4在癲癇治療中的作用一直是研究熱點，Binder等[8]發(fā)現(xiàn)AQP4敲除可提高癲癇發(fā)作的閾值，提示神經(jīng)膠質(zhì)的AQP4可能參與了腦興奮性活動的調(diào)節(jié)。在對海馬硬化的中央顳葉癲癇患者的研究中發(fā)現(xiàn)，硬化海馬中水含量增多。通過采用定量RT-PCR分析、免疫組織化學(xué)和高通量免疫金標(biāo)記的方法檢測發(fā)現(xiàn)，硬化的海馬中AQP4表達(dá)明顯上調(diào)[9]。腹腔注射鋰-匹羅卡品建立SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，在6、12、24、48、72、96、120、168 h分別用免疫組化和RT-PCR方法檢測AQP4的表達(dá)，結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)24 h后腦組織AQP4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增高，48 h達(dá)到高峰，持續(xù)72 h后下降，并且AQP4的動態(tài)表達(dá)變化和腦水腫形成過程呈正相關(guān)[10]。以上研究說明AQP4與癲癇疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，AQP4很可能成為癲癇治療研究的新靶點。

本實驗采用大鼠皮下注射海人酸方法建立了大鼠癲癇模型，它是研究難治性癲癇發(fā)病機制及藥物治療的良好模型。RT-PCR和Western blot結(jié)果均表明，海人酸組中海馬AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比對照組顯著增多（P < 0.05），與Alvestad等[11]報道一致。進一步用雷公藤內(nèi)酯干預(yù)發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比海人酸組顯著減少（P < 0.05）。結(jié)果提示，雷公藤內(nèi)酯可下調(diào)AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，可以作為臨床治療難治性癲癇的候選藥物之一。但是雷公藤內(nèi)酯對其下調(diào)的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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[3] 楊宜承，趙薇，曾常茜，等.雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠神經(jīng)元caspase3和caspase9蛋白表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（2）：48-50.

[4] 張勇.水通道蛋白4及其在癲癇研究中的進展[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（5）：318-320.

[5] 周海燕.癲癇持續(xù)狀態(tài)對幼年大鼠海馬早期影響及雷公藤甲素保護作用的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2012.

[6] Zhou HF，Liu XY，Niu DB，et al. Triptolide protects dopaminergic neurons from inflammation-mediated damage induced by lipopolysaccharide intranigral injection [J]. Neurobiol Dis，2005，18（3）： 441-449.

[7] Yool AJ. Aquaporins： multiple roles in the central nervous system [J]. Neuroscientist，2007，13（5）：470-485.

[8] Binder DK，Oshio K，Ma T，et al. Increased seizure threshold in mice lacking aquaporin-4 water channels [J]. Neuroreport，2004，15：259-262.

[9] Lee TS，Eid T，Mane S，et al. Aquaporin-4 is increased in the sclerotic hippocampus in human temporal lobe epilepsy [J]. Acta Neuropathoi，2004，108（6）：493-502.

[10] 蒙蘭青，韋世革，黃瑞雅，等.大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后水通道蛋白4的表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（2）：144-147.

[11] Alvestad S，Hammer J，Hoddevik EH，et al. Mislocalization of AQP4 precedes chronic seizures in the kainate model of temporal lobe epilepsy [J]. Epilepsy Res，2013，105（1）：30-41.

（收稿日期：2013-12-11 本文編輯：程 銘）

1：對照組，2：海人酸組，3：雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組；與對照組比較，

★P < 0.05；與海人酸組比較，☆P < 0.05

圖2 雷公藤內(nèi)酯對大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4 mRNA水平的影響

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病之一，全世界癲癇患者總數(shù)達(dá)3000萬人，且我國每年有45萬新增患者，總數(shù)約650萬[5]，其中約有1/4的患者治療后不能有效控制發(fā)作，轉(zhuǎn)為難治性癲癇；而約有2/3的難治性癲癇為顳葉癲癇。顳葉癲癇的臨床特征是反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)性癲癇發(fā)作，最明顯的病理改變是海馬組織硬化，病情進展迅速，預(yù)后極差。因此積極尋求高效、安全、毒副作用小的抗癇新藥及治療新靶點已成為臨床及基礎(chǔ)研究的重中之重。

雷公藤內(nèi)酯是從雷公藤中分離出來的單體，毒性較小。它可以透過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。大量研究顯示，雷公藤內(nèi)酯可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎癥因子及促炎癥細(xì)胞因子的釋放，對神經(jīng)元具有明確的保護作用[5-6]，但其對水通道蛋白家族作用的分子機制方面研究報道較少。

AQP4是大腦內(nèi)的主要水通道蛋白，在軟腦膜、室管膜、脈絡(luò)叢及海馬、視上核、下丘腦等均有顯著的表達(dá)[7]。AQP4在神經(jīng)系統(tǒng)主要有控制腦內(nèi)水分的流動，易化星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性等作用，參與了腦缺血、顱內(nèi)感染、腦腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)過程。AQP4在癲癇治療中的作用一直是研究熱點，Binder等[8]發(fā)現(xiàn)AQP4敲除可提高癲癇發(fā)作的閾值，提示神經(jīng)膠質(zhì)的AQP4可能參與了腦興奮性活動的調(diào)節(jié)。在對海馬硬化的中央顳葉癲癇患者的研究中發(fā)現(xiàn)，硬化海馬中水含量增多。通過采用定量RT-PCR分析、免疫組織化學(xué)和高通量免疫金標(biāo)記的方法檢測發(fā)現(xiàn)，硬化的海馬中AQP4表達(dá)明顯上調(diào)[9]。腹腔注射鋰-匹羅卡品建立SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，在6、12、24、48、72、96、120、168 h分別用免疫組化和RT-PCR方法檢測AQP4的表達(dá)，結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)24 h后腦組織AQP4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增高，48 h達(dá)到高峰，持續(xù)72 h后下降，并且AQP4的動態(tài)表達(dá)變化和腦水腫形成過程呈正相關(guān)[10]。以上研究說明AQP4與癲癇疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，AQP4很可能成為癲癇治療研究的新靶點。

本實驗采用大鼠皮下注射海人酸方法建立了大鼠癲癇模型，它是研究難治性癲癇發(fā)病機制及藥物治療的良好模型。RT-PCR和Western blot結(jié)果均表明，海人酸組中海馬AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比對照組顯著增多（P < 0.05），與Alvestad等[11]報道一致。進一步用雷公藤內(nèi)酯干預(yù)發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP4蛋白和mRNA表達(dá)水平比海人酸組顯著減少（P < 0.05）。結(jié)果提示，雷公藤內(nèi)酯可下調(diào)AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，可以作為臨床治療難治性癲癇的候選藥物之一。但是雷公藤內(nèi)酯對其下調(diào)的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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（收稿日期：2013-12-11 本文編輯：程 銘）