趙慶杰，原現(xiàn)軍，郭剛，聞愛(ài)友，巴桑，王奇，沈振西，余成群，邵濤＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇 南京210095；2.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京100101；3.西藏日喀則地區(qū)草原工作站，西藏 日喀則857000；4.海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院儋州校區(qū)，海南 儋州571737）

西藏由于特殊的地理位置和生態(tài)條件，草地生態(tài)系統(tǒng)極為脆弱，抗干擾能力很低，植被一旦遭到破壞恢復(fù)困難，畜牧業(yè)難以可持續(xù)發(fā)展。近年來(lái)，西藏地區(qū)隨著人口的增加和畜牧業(yè)的發(fā)展，單純依賴天然草地已經(jīng)不能滿足家畜對(duì)飼草料的需求。因此，在西藏“一江兩河”農(nóng)區(qū)開展優(yōu)質(zhì)牧草的種植、加工貯藏，解決冬春季牧區(qū)飼草料短缺問(wèn)題，不但可以緩解家畜增多對(duì)天然草地造成的壓力，使草地生態(tài)功能得以恢復(fù)，同時(shí)也能促進(jìn)畜牧業(yè)生產(chǎn)效率的提高。

西藏日喀則地區(qū)以“世界青稞之鄉(xiāng)”著稱，是第一大糧食作物，青稞（Hordeumvulgare）秸稈資源較豐富，但其水溶性碳水化合物含量低、粗纖維含量高、質(zhì)地粗硬，直接利用適口性差、可消化養(yǎng)分低，單獨(dú)青貯也較難獲得成功。多年生黑麥草（Loliumperenne）生長(zhǎng)速度快，再生能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好，在日喀則地區(qū)也有一定的種植面積；將青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯，既可以克服青稞秸稈單獨(dú)青貯發(fā)酵品質(zhì)差及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低的缺點(diǎn)，又可以解決在西藏地區(qū)單純利用牧草開展青貯飼料生產(chǎn)所帶來(lái)的青貯原料不足的問(wèn)題。

優(yōu)質(zhì)青貯飼料調(diào)制所必備的條件是嚴(yán)格的厭氧條件、原料中充足的乳酸菌數(shù)量和活性及足夠的發(fā)酵底物，因此添加乳酸菌制劑和糖蜜是改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的有效措施。蔡義民等［1］以意大利黑麥草（Loliummultiflorum）為材料，添加2種乳酸球菌和1種乳酸桿菌進(jìn)行青貯飼料調(diào)制，結(jié)果表明添加乳酸菌可以提高乳酸含量，降低pH，有效抑制了霉菌、酵母菌等有害微生物的繁殖。Kung等［2］研究發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌的玉米（Zeamays）青貯飼料中乳酸、乙酸含量均有提高，但其他成分變化較小。張靜等［3］在多花黑麥草青貯中添加乳酸菌制劑顯著提高了青貯飼料的乳酸含量，降低了pH。Weinberg等［4］為了將橄欖餅用作反芻動(dòng)物飼料，將其青貯并添加糖蜜發(fā)現(xiàn)，糖蜜添加組乳酸含量和乳酸菌數(shù)量均顯著提高。Hashemzadeh－Cigari等［5］對(duì)苜蓿（Medicagosativa）青貯時(shí)添加糖蜜，并接種乳酸菌，發(fā)現(xiàn)組合添加對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善效果優(yōu)于糖蜜單獨(dú)添加。

本研究旨在根據(jù)前期青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯比例篩選研究結(jié)果［6］，進(jìn)一步添加乳酸菌制劑和糖蜜探討其對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，確定改善混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將種植于西藏日喀則地區(qū)草原工作站試驗(yàn)地的青稞和多年生黑麥草于2012年8月24日刈割，青稞秸稈為去除籽粒后的莖桿，多年生黑麥草刈割時(shí)處于抽穗初期。青稞秸稈和多年生黑麥草主要化學(xué)成分見(jiàn)表1。

乳酸菌制劑由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院飼草調(diào)制加工與貯藏研究所和西藏高原草業(yè)工程技術(shù)研究中心共同研制，主要由植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌以及葡萄糖等組成；糖蜜為制糖副產(chǎn)品，主要成分為蔗糖，紅褐色粘稠液體。

實(shí)驗(yàn)室青貯窖采用容積為2L的塑料容器。

表1 青稞秸稈和多年生黑麥草主要化學(xué)成分Table 1 Chemical compositions of hullessbarley straw and perennial ryegrass

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)對(duì)照組（Control）、乳酸菌制劑組（LAB，2g/kg鮮重）、糖蜜組（M，40g/kg鮮重）、乳酸菌制劑＋糖蜜組（LAB＋M）4個(gè)處理組。每個(gè)處理各時(shí)間點(diǎn)6個(gè)重復(fù)，在青貯后的第7，24和45天打開青貯容器，取樣分析各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)方法

各青貯原料用鍘刀切成2cm左右后，將青稞秸稈和多年生黑麥草以4∶6的鮮重比充分混勻，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)量添加糖蜜和乳酸菌制劑，再次充分混合均勻。裝填至2L的實(shí)驗(yàn)室青貯窖中，壓實(shí)后蓋上內(nèi)外蓋，并用膠帶密封，置于室溫下保存。

在青貯后第7，24和45天分別打開青貯窖，取出全部樣品充分混合均勻，按“四分法”稱取35g樣品，放入100mL三角瓶中，加入70g去離子水，置于4℃冰箱內(nèi)浸提24h，然后通過(guò)2層紗布和定性濾紙，所得液體為青貯飼料浸提液，置于－20℃冷凍冰箱保存待測(cè)。浸提液用來(lái)測(cè)定pH、乳酸、氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸。將剩余部分青貯飼料收集烘干粉碎，測(cè)定干物質(zhì)、總氮以及水溶性碳水化合物。其中總氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定［7］，水溶性碳水化合物含量采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定［8］。

原料草和青貯飼料在65℃條件下烘60h以上至恒重，測(cè)定干物質(zhì)含量（dry matter，DM）；pH使用HANNA pH211型pH 計(jì)測(cè)定；乳酸（lactic acid，LA）含量采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定［9］；氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，AN）含量采用苯酚－次氯酸鈉比色法測(cè)定［10］。揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acids）包括乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）采用高效氣相色譜儀（日本島津 GC－14B型，色譜柱為30m×0.25mm×0.25μm毛細(xì)管柱）測(cè)定，條件為：柱溫140℃，汽化室溫度180℃，氫氣檢測(cè)器溫度220℃，檢測(cè)器FID，載氣為氮?dú)猓瑝毫?.05MPa，氫氣壓力為0.05MPa，氧氣壓力為0.05MPa。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SAS（9.2）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析（ANOVA），并用Duncan方法對(duì)處理間及青貯天數(shù)間數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中pH、干物質(zhì)和乳酸含量的影響

由表2可見(jiàn)，隨著青貯的進(jìn)行各組干物質(zhì)含量無(wú)明顯（P＞0.05）變化。整個(gè)青貯過(guò)程中，M和LAB＋M組干物質(zhì)含量始終顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組和LAB組，LAB組干物質(zhì)含量在青貯前24d顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組，之后逐漸降至與對(duì)照組相同的水平（P＞0.05）。

青貯第7天M和LAB＋M組乳酸含量顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組和LAB處理組，之后對(duì)照組和LAB組乳酸含量顯著（P＜0.05）上升，至青貯第24天與 M和LAB＋M組基本持平（P＞0.05），此后趨于穩(wěn)定，而 M和LAB＋M組乳酸含量繼續(xù)上升，到青貯第45天又顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。相應(yīng)地，pH呈現(xiàn)與乳酸含量相反的變化趨勢(shì)，在青貯第7天各添加劑處理組pH顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組，其中M和LAB＋M組顯著（P＜0.05）低于LAB處理組，之后各組基本趨于穩(wěn)定，在青貯結(jié)束時(shí)各添加劑處理組pH均低于對(duì)照組，其中LAB＋M組pH最低，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中pH值、干物質(zhì)和乳酸含量的影響Table 2 Effect of adding lactobacillus and molasses on pH，DM and LA contents of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

2.2 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表3可見(jiàn)，隨著青貯的進(jìn)行，各組乙酸含量均呈逐漸上升趨勢(shì)，其中LAB組24d后乙酸含量顯著（P＜0.05）上升。整個(gè)青貯過(guò)程中LAB組始終顯示最低的乙酸含量。隨著青貯的進(jìn)行，各組揮發(fā)性脂肪酸不斷積累，呈現(xiàn)與乙酸相似的變化趨勢(shì)。

各組丙酸和丁酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈上升趨勢(shì)，其中青貯45d各添加組丙酸含量均低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。整個(gè)青貯過(guò)程中LAB組呈現(xiàn)最高的丁酸含量，其中第24和45天顯著（P＜0.05）高于其他各組。

在整個(gè)青貯過(guò)程中，LA/AA值隨著乳酸和乙酸的變化，呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，但各添加組LA/AA值始終高于（P＞0.05）或顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。

表3 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 3 Effect of adding lactobacillus and molasses on volatile fatty acid contents of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

2.3 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中氨態(tài)氮/總氮和水溶性碳水化合物含量的影響

青貯第7天LAB組AN/TN值顯著（P＜0.05）高于其他各組（表4），之后各組雖略有波動(dòng)但總體保持穩(wěn)定，其中LAB組AN/TN值始終保持最高值，至青貯結(jié)束時(shí)仍顯著（P＜0.05）高于其他各組，而其他各組間無(wú)顯著（P＞0.05）差異。

隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，各組水溶性碳水化合物含量逐漸下降。在青貯第7天M和LAB＋M組水溶性碳水化合物含量高于LAB組和對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05），之后各組水溶性碳水化合物含量顯著（P＜0.05）下降，在青貯第24天M和LAB＋M組水溶性碳水化合物含量開始顯著（P＜0.05）高于LAB組和對(duì)照組，并且一直保持到青貯結(jié)束。

3 討論

本試驗(yàn)采用塑料容器模擬生產(chǎn)青貯窖，快速裝填，且密封良好，無(wú)流汁損失［11］，因此整個(gè)青貯過(guò)程中干物質(zhì)含量無(wú)明顯變化。青貯60d后對(duì)照組和LAB組干物質(zhì)含量顯著低于M和LAB＋M組，這可能是由于整個(gè)青貯過(guò)程中對(duì)照組和LAB組pH始終較高，未能有效抑制有害微生物活性，造成營(yíng)養(yǎng)成分損失，從而導(dǎo)致干物質(zhì)含量下降［12］。

青貯第7天，乳酸菌制劑處理組乳酸含量顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組，pH顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組，這是由于添加乳酸菌制劑增加了乳酸菌數(shù)量，促使青貯初期（7d）乳酸快速產(chǎn)生，進(jìn)而使pH快速下降。Gao等［13］將植物乳桿菌（Lactobacillaceaeplantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillaceaefermentum）和副干酪乳桿菌（Lactobacillaceaeparacasei）混合物接種到水稻（Oryzasativa）秸稈中進(jìn)行青貯，發(fā)現(xiàn)顯著改善了青貯發(fā)酵品質(zhì)，提高了乳酸含量，降低了pH。青貯第7天糖蜜添加組乳酸含量顯著高于對(duì)照組，pH已降至4.07，顯著低于對(duì)照組的4.85，這是由于糖蜜富含水溶性碳水化合物，可為乳酸菌提供較為充足的發(fā)酵底物，促使乳酸菌快速繁殖并占主導(dǎo)地位，乳酸快速生成，pH迅速下降［14－15］。這與Aksu等［16］研究結(jié)果一致，Aksu等［16］在玉米青貯時(shí)添加糖蜜，顯著提高了青貯飼料的乳酸含量。糖蜜和乳酸菌制劑組合添加組發(fā)酵品質(zhì)與糖蜜單獨(dú)添加組發(fā)酵品質(zhì)相近，無(wú)顯著差異，但與乳酸菌制劑單獨(dú)添加組相比，進(jìn)一步提高了乳酸含量，降低了pH，同時(shí)本試驗(yàn)中糖蜜單獨(dú)添加組發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于乳酸菌單獨(dú)添加組，由此表明水溶性碳水化合物缺乏對(duì)青稞秸稈和多年生黑麥草混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的限制作用大于乳酸菌。Seale等［17］也指出影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的因素很多，其中青貯材料水溶性碳水化合物含量是影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的主要因素之一。

表4 添加乳酸菌制劑和糖蜜對(duì)青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯過(guò)程中氨態(tài)氮/總氮和水溶性碳水化合物含量的影響Table 4 Effect of adding lactobacillus and molasses on WSC content and AN/TN of mixed silages of hullessbarley straw and perennial ryegrass during ensiling

青貯飼料中乙酸一部分是由發(fā)酵初期乙酸菌等好氧性微生物代謝產(chǎn)生，隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，異質(zhì)型乳酸菌逐漸占主導(dǎo)，也會(huì)產(chǎn)生部分乙酸。本試驗(yàn)中，各組乙酸大部分產(chǎn)生于青貯前7d，隨著青貯的進(jìn)行乙酸含量也逐漸增加，可能是青貯后期，異質(zhì)型乳酸菌逐漸活躍所致。本試驗(yàn)添加糖蜜提高了乙酸含量，表明糖蜜不僅促進(jìn)了青貯早期同型乳酸發(fā)酵，同時(shí)也為異質(zhì)型乳酸菌提供了發(fā)酵底物，因此產(chǎn)生了較高的乙酸含量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示乳酸菌單獨(dú)添加組乙酸含量低于對(duì)照組，乳酸/乙酸值顯著高于對(duì)照組，這是由于本試驗(yàn)所使用的乳酸菌制劑主要以植物乳桿菌為主，而植物乳桿菌是同質(zhì)型乳酸菌，與發(fā)酵過(guò)程中異質(zhì)型乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)發(fā)酵底物，從而減少乙酸的生成。

研究表明丙酸菌活性在pH低于4.8時(shí)已被抑制［18－19］，本試驗(yàn)中僅對(duì)照組在青貯第7天pH高于4.8，因此各組僅檢測(cè)到微量丙酸，其中對(duì)照組最高達(dá)到1.08g/kg DM。丁酸主要由丁酸菌代謝產(chǎn)生，并且伴隨著較高的pH和蛋白質(zhì)的降解［20］，本試驗(yàn)中乳酸菌制劑添加組第45天丁酸含量顯著高于對(duì)照組，表明青貯后期由于pH較高，未能完全有效地抑制有害微生物活性，尤其是丁酸菌的繁殖。

氨態(tài)氮/總氮值能夠反映青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度，一般認(rèn)為常規(guī)優(yōu)質(zhì)青貯飼料的氨態(tài)氮/總氮應(yīng)小于100g/kg TN［21］，本試驗(yàn)中各組氨態(tài)氮/總氮均小于此值，但乳酸菌制劑處理組顯著高于其他各組，這與乳酸菌制劑組有較高的丁酸含量是一致的，因此表明氨態(tài)氮和丁酸的生成可能是梭菌活躍的產(chǎn)物。Bergen等［22］研究表明，梭菌主要有2種類型分別是蛋白降解型梭菌和糖降解型梭菌，其中糖降解型梭菌主要代謝水溶性碳水化合物產(chǎn)生丁酸，而蛋白降解型梭菌在生成丁酸的同時(shí)，也降解蛋白質(zhì)和氨基酸，生成氨態(tài)氮。本試驗(yàn)中乳酸菌制劑添加組丁酸和氨態(tài)氮/總氮均高于其他各組，可能是由于梭菌活躍所致。Kwak等［23］關(guān)于平菇菌糠飼料化研究中，通過(guò)添加糖蜜和接種植物乳桿菌改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌組氨態(tài)氮/總氮高于對(duì)照組，本試驗(yàn)結(jié)論與此一致。

添加糖蜜直接補(bǔ)充了發(fā)酵底物，使得糖蜜處理組（包括單獨(dú)添加和組合添加）殘留水溶性碳水化合物含量高于對(duì)照。而乳酸菌制劑增加了乳酸菌數(shù)量，消耗了更多的發(fā)酵底物產(chǎn)生乳酸，因此顯示較低的水溶性碳水化合物含量。

4 結(jié)論

綜上所述，添加乳酸菌制劑直接增加了乳酸菌數(shù)量，提高了青貯早期乳酸發(fā)酵速度，但青貯后期，由于糖分不足，pH有所上升，未能抑制有害微生物的活性，使得丁酸和氨態(tài)氮含量有所提高。添加糖蜜增加了乳酸菌發(fā)酵底物，促進(jìn)了乳酸發(fā)酵，降低了pH，從而抑制了有害微生物的繁殖，提高了青貯發(fā)酵品質(zhì)。組合添加乳酸菌制劑和糖蜜與單獨(dú)添加乳酸菌制劑相比顯著提高了青貯發(fā)酵品質(zhì)，但與單獨(dú)添加糖蜜相比差異不顯著，表明水溶性碳水化合物不足是限制青稞秸稈與多年生黑麥草混合青貯發(fā)酵的主要因素。

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