孟亞雄，王世紅，汪軍成，徐先良，賴(lài)勇，司二靜，馬小樂(lè)，2，李葆春，3，楊軻，2，王化俊，2＊

（1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；4.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥所，甘肅 蘭州730070）

土壤鹽漬化是全世界范圍內(nèi)影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的一種主要的非生物脅迫［1］，種子萌發(fā)和幼苗期耐鹽性對(duì)植物在鹽漬環(huán)境下的形態(tài)建成有至關(guān)重要的作用［2－3］。我國(guó)不同程度鹽漬化土地占可耕地面積的1/4，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展［4］，提高作物耐鹽堿能力，改善作物對(duì)鹽漬環(huán)境的適應(yīng)性，是當(dāng)前加強(qiáng)開(kāi)發(fā)和利用鹽漬化土壤的有效措施之一。大麥（Hordeumvulgare）是一種主要的糧飼兼用作物，在作物中其耐鹽性?xún)H次于棉花，常作為鹽堿地的先鋒作物種植［5］，研究大麥對(duì)鹽脅迫逆境的適應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。

鈷是土壤中廣泛存在的許多植物和微生物保持正常代謝功能所必需的微量元素之一，也是豆科植物固氮作用所必需的元素［6－7］?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，通過(guò)噴施于土壤或植物葉面等方式施入適宜濃度的鈷會(huì)促進(jìn)多種植物生長(zhǎng)［8－9］，提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)［10－12］，植物生長(zhǎng)參數(shù)與光合色素含量明顯提高［13］。培養(yǎng)基中添加適量的 CoCl2促進(jìn)了蘋(píng)果（Malusdomestica）、玫瑰（Rosarugosa）等體外幼芽的生根，且根的生長(zhǎng)加快［14－15］。同時(shí)，鈷在植物逆境脅迫中也起到了一些積極的作用［16］，如適量的鈷對(duì)Na2CO3脅迫下紫花苜蓿（Medicagosativa）幼苗葉片細(xì)胞膜表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用［17］；可以緩解干旱脅迫對(duì)大豆（Glycinemax）葉片的傷害程度［18］；提高了酸脅迫下多花黑麥草（Loliummultiflorum）種子萌發(fā)及幼苗抗性［19］；能有效緩解海水脅迫對(duì)油菜（Brassicacampestris）幼苗的傷害，誘導(dǎo)增強(qiáng)其耐鹽性，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)［20］。但Co2＋對(duì)大麥幼苗鹽脅迫逆境下的生理作用還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)就CoCl2對(duì)NaCl脅迫下大麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)特性的影響進(jìn)行研究，探討了CoCl2對(duì)不同程度NaCl脅迫的緩解作用，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鈷在植物逆境脅迫中的生理作用，為鹽漬地大麥種植與生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理及方法

試驗(yàn)于2012年11月初進(jìn)行，供試大麥種子“博樂(lè)”由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)前將種子用15%次氯酸鈉溶液浸種15min消毒，蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，均勻排列在鋪有雙層濾紙的直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，每皿40粒，每個(gè)處理3次重復(fù)。以Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制不同處理的培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10mL培養(yǎng)液，試驗(yàn)處理分為2組：I.加入 NaCl濃度分別為30，60，90，120mmol/L，CoCl2濃度為0.1mmol/L的培養(yǎng)液；Ⅱ.加入NaCl濃度分別為30，60，90，120mmol/L的培養(yǎng)液，以Hoagland營(yíng)養(yǎng)液正常培養(yǎng)為對(duì)照（CK）。置于光強(qiáng)為4000lx、12h光照/黑暗、相對(duì)濕度保持在75%左右、24℃的人工氣候箱中培養(yǎng)14d，培養(yǎng)過(guò)程中每24 h更換1次等體積培養(yǎng)液，觀察種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)情況。于相應(yīng)時(shí)期測(cè)定種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、幼苗內(nèi)源激素、抗氧化酶活性以及丙二醛含量。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)情況 依照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（2012版）進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。每天8：00－9：00觀察種子發(fā)芽情況，并記錄種子發(fā)芽數(shù)，以有根有芽、芽長(zhǎng)為種子1/2長(zhǎng)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)［21］，計(jì)算3d發(fā)芽勢(shì)（發(fā)芽3d時(shí)日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰）、7d發(fā)芽率；第7天用游標(biāo)卡尺測(cè)量苗高和根長(zhǎng)，每個(gè)處理30株（每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取10株）。

1.2.2 幼苗內(nèi)源激素的測(cè)定 第7天對(duì)幼苗的內(nèi)源激素進(jìn)行測(cè)定，稱(chēng)取鮮樣1.0g。提取和測(cè)定的方法均根據(jù)王若仲等［22］的操作方法進(jìn)行。采用高效液相色譜法（HPLC）分別測(cè)定吲哚－3－乙酸 （IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量。所用色譜柱：Eclipse plus C18（4.6mm×250mm，5μm），柱溫：25℃；流動(dòng)相：0.05%甲酸－甲醇（1∶1），流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：220，200，262nm。

1.2.3 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 第14天對(duì)幼苗進(jìn)行抗氧化酶活性與丙二醛含量的測(cè)定，各稱(chēng)取鮮樣0.3g。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT光還原法測(cè)定［23］，以可抑制NBT光還原反應(yīng)50%的酶量作為1個(gè)SOD活性單位；過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［24］；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測(cè)定［23］；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法測(cè)定［23］。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法檢測(cè)差異顯著性，并進(jìn)行多重比較，各數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下CoCl2處理對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

各處理大麥種子發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率呈相似變化趨勢(shì)，如表1所示，隨著NaCl脅迫濃度的提高，種子發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率逐漸下降，NaCl脅迫顯著抑制了種子萌發(fā)；添加0.1mmol/L CoCl2能在一定程度上緩解NaCl脅迫而顯著提高種子的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率，且這種緩解作用隨著NaCl濃度的增大而加強(qiáng)。其中NaCl濃度在90mmol/L以上時(shí)，CoCl2對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率提高作用最明顯，發(fā)芽勢(shì)比相同NaCl脅迫處理分別提高7.50%和5.84%，發(fā)芽率分別提高了8.33%和10.84%。

隨著NaCl脅迫程度的加重，大麥芽與根的生長(zhǎng)受到的抑制作用越明顯，0.1mmol/L CoCl2處理對(duì)NaCl脅迫下芽與根的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，其促進(jìn)作用的大小因NaCl濃度而異。但30mmol/L NaCl處理下的幼苗根長(zhǎng)略長(zhǎng)于CK，輕度NaCl脅迫刺激了根的生長(zhǎng)，而此NaCl濃度下0.1mmol/L CoCl2處理幼苗根長(zhǎng)顯著高于CK，CoCl2處理有助于大麥根的生長(zhǎng)。CoCl2處理對(duì)NaCl脅迫下芽與根的生長(zhǎng)促進(jìn)作用在較高NaCl濃度下更明顯，當(dāng)NaCl濃度為90和120mmol/L時(shí)，添加CoCl2處理使苗長(zhǎng)比相同NaCl脅迫提高25.12%和27.88%，根長(zhǎng)分別比相同NaCl脅迫提高23.59%和25.0%。

表1 CoCl2處理對(duì)NaCl脅迫下大麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Influences of CoCl2on germination of seeds and seedlings growth of barley under NaCl stress

2.2 NaCl脅迫下CoCl2處理對(duì)大麥幼苗內(nèi)源激素含量的影響

NaCl脅迫下0.1mmol/L CoCl2處理大麥幼苗吲哚－3－乙酸 （IAA），赤霉素（GA3），脫落酸（ABA）含量與（IAA＋GA3）/ABA的變化情況如圖1所示。隨著NaCl濃度的升高，幼苗IAA含量顯著降低，添加0.1 mmol/L CoCl2對(duì)NaCl脅迫下IAA含量的變化趨勢(shì)無(wú)明顯影響，與相同濃度NaCl脅迫處理差異不顯著；幼苗GA3含量的變化與IAA相似，呈顯著下降的趨勢(shì)，但NaCl濃度為60mmol/L時(shí)，0.1mmol/L CoCl2顯著促進(jìn)了GA3的生成，其余NaCl脅迫處理下對(duì)GA3的含量影響不明顯；ABA對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為隨著NaCl脅迫的加重，幼苗ABA含量極顯著升高，添加0.1mmol/L CoCl2處理ABA含量的上升幅度減緩，且與相同NaCl脅迫處理相比較，極顯著降低；0.1mmol/L CoCl2處理不同NaCl脅迫程度的幼苗，生長(zhǎng)型激素（IAA＋GA3）與抑制型激素ABA的比值得到了顯著提高，與相同NaCl濃度處理比較，分別提高了0.43，0.60，2.23和1.03倍。由此可見(jiàn)，CoCl2對(duì)NaCl脅迫下幼苗體內(nèi)激素含量水平及平衡狀況產(chǎn)生了影響，且對(duì)較高濃度NaCl脅迫下的ABA積累抑制最明顯。

2.3 NaCl脅迫下CoCl2處理對(duì)大麥幼苗抗氧化酶活性與MDA含量的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）與過(guò)氧化物酶（POD）是植物細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶［25］，MDA是反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)［26］。由圖2可以看出，隨著NaCl脅迫程度不斷加劇，大麥幼苗SOD、CAT的活性持續(xù)升高，POD的活性先升高后降低，其中以SOD活性升幅最大，CAT次之，POD在NaCl濃度為60mmol/L時(shí)活性最強(qiáng)。0.1mmol/L CoCl2處理后，NaCl脅迫下幼苗SOD、CAT和POD的活性得到不同程度提高，但變化趨勢(shì)并沒(méi)有改變，在各個(gè)濃度NaCl處理中，幼苗SOD活性顯著高于相同NaCl濃度處理；幼苗POD活性除30mmol/L NaCl處理時(shí)升高不顯著外，在其余NaCl濃度處理下顯著提高；NaCl濃度在60mmol/L以上時(shí)，CAT活性顯著提高；MDA隨著NaCl濃度的提高含量不斷上升，0.1mmol/L CoCl2處理后大麥幼苗 MDA積累減緩，NaCl濃度在60mmol/L以上時(shí)，MDA含量與相同NaCl濃度處理比較差異顯著，CoCl2緩解NaCl脅迫對(duì)幼苗膜脂質(zhì)過(guò)氧化傷害的作用越明顯。

3 討論

圖1 CoCl2處理對(duì)NaCl脅迫下大麥幼苗IAA、GA3、ABA含量與（IAA＋GA3）/ABA的影響Fig.1 Influences of CoCl2on IAA，GA3，ABA contents and（IAA＋GA3）/ABA of seedlings of barley under NaCl stress

圖2 CoCl2處理對(duì)NaCl脅迫下大麥幼苗SOD、CAT、POD活性和MDA含量的影響Fig.2 Influences of CoCl2on SOD，CAT，POD activities and MDA content of seedlings of barley under NaCl stress

植物激素作為痕量信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)植物各種生長(zhǎng)進(jìn)程與環(huán)境響應(yīng)過(guò)程中有著很重要的作用［27］，在鹽脅迫下，植物通過(guò)刺激或抑制內(nèi)源激素的合成來(lái)適應(yīng)鹽生環(huán)境［28］。Hashem等［29］研究表明，鹽脅迫下IAA與GA3的生成受到顯著抑制，而ABA大量生成。積累的ABA介導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而限制了光合作用，降低生物產(chǎn)量，同時(shí)伴隨著活性氧（ROS）的產(chǎn)生［30］。在本試驗(yàn)中，隨著鹽脅迫的加重，大麥幼苗生長(zhǎng)型激素IAA與GA3的合成明顯受阻，抑制型激素ABA的含量迅速提高；芽與根的伸長(zhǎng)速度減緩，NaCl脅迫抑制幼苗生長(zhǎng)的作用顯著加強(qiáng)，這與上述研究一致。在不同濃度NaCl脅迫水平下，添加0.1mmol/L CoCl2處理后，幼芽IAA與GA3的生成無(wú)明顯變化，ABA的生成受到顯著抑制，且在較高NaCl濃度下抑制作用更明顯，幼苗生長(zhǎng)加快，這可能與CoCl2的生理功能有關(guān)，即鈷作為乙烯合成酶1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶（ACC）的抑制劑，通過(guò)抑制該酶的活性，可顯著抑制乙烯的產(chǎn)生［31］；在鹽脅迫下，與乙烯生物合成途徑相關(guān)的酶活性顯著增強(qiáng)，從而促使乙烯大量生成［32］，而誘導(dǎo)產(chǎn)生的乙烯與ABA的積累有關(guān)，乙烯的積累加強(qiáng)了ABA的生物合成［33］。最終，鈷元素通過(guò)抑制乙烯的產(chǎn)生而減緩了鹽脅迫下ABA的積累，提高了生長(zhǎng)型激素（IAA＋GA3）與抑制型激素（ABA）的比值，促進(jìn)了大麥根與芽的生長(zhǎng)，而根系的良好生長(zhǎng)狀態(tài)加強(qiáng)了NaCl脅迫下對(duì)養(yǎng)分與水分的吸收能力，從而提高了幼苗對(duì)鹽脅迫逆境的適應(yīng)性［34］。

植物在各種逆境環(huán)境脅迫下會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，加快ROS的產(chǎn)生，如單線(xiàn)態(tài)氧（1O2），超氧陰離子自由基（O2－），過(guò)氧化氫（H2O2）等，同時(shí)鹽誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉限制了葉片對(duì)CO2的攝取能力，降低和抑制了光合作用的進(jìn)行，進(jìn)而加快了葉綠體中ROS的生成［35］。增加的ROS通過(guò)對(duì)脂類(lèi)，蛋白質(zhì)和核酸等的氧化損傷嚴(yán)重破壞了細(xì)胞內(nèi)的平衡狀態(tài)和正常的生長(zhǎng)代謝［36］。植物通過(guò)抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)來(lái)清除這些ROS，且抗氧化能力直接關(guān)系到耐鹽性的強(qiáng)弱［37］。在此試驗(yàn)中，隨著NaCl脅迫程度的不斷加劇，大麥幼苗SOD、POD活性顯著上升，CAT活性先升高后降低，這與甘草（Glycyrrhizauralensis）、藜草（Chenopodiumalbum）等幼苗抗氧化物酶響應(yīng)鹽脅迫的研究相似［38－39］；Tewari等［40］、Sinha等［41］研究發(fā)現(xiàn)，外源鈷可以顯著降低 CAT的活性與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高POD與SOD等保護(hù)酶的活性。本研究結(jié)果也顯示0.1mmol/L CoCl2處理顯著誘導(dǎo)了鹽脅迫下大麥幼苗SOD、POD與CAT活性的提高，從而有效緩解了NaCl脅迫下ROS的產(chǎn)生速率，降低了細(xì)胞MDA含量，減緩了脂質(zhì)過(guò)氧化程度的加劇，且在較嚴(yán)重NaCl脅迫下對(duì)抗氧化物酶活力的提高與減緩脂質(zhì)過(guò)氧化水平的作用更顯著。但0.1mmol/L CoCl2處理并沒(méi)有顯著抑制CAT活性的增強(qiáng)，反而促進(jìn)了其活性的升高，這可能是在NaCl脅迫下，較低濃度的Co2＋并不會(huì)造成重金屬離子誘導(dǎo)氧化損傷的毒害作用，反而會(huì)促進(jìn)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)協(xié)同清除ROS，緩解了NaCl脅迫對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷程度。

4 結(jié)論

當(dāng)大麥幼苗由于NaCl脅迫而遭受較為嚴(yán)重的細(xì)胞傷害時(shí)，0.1mmol/L CoCl2通過(guò)抑制ABA含量的積累與提高抗氧化酶活性，提高了內(nèi)源激素（IAA＋GA3）/ABA的值，加強(qiáng)了細(xì)胞清除活性氧的能力，有效減緩了細(xì)胞中活性氧的大量累積、脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，從而對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，提高了幼苗對(duì)NaCl脅迫環(huán)境的適應(yīng)性。

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