陳 超， 蔡天革， 張榮華， 楊 麗， 蔡 宇*

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510630； 2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；3.暨南大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510632）

［藥 理］

6 種中藥活性成分對(duì) K562/ADM 耐藥性逆轉(zhuǎn)及 P27 和 P170 蛋白表達(dá)影響

陳 超1， 蔡天革2， 張榮華3， 楊 麗3， 蔡 宇3*

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510630； 2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；3.暨南大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510632）

目的 觀察中藥活性成分對(duì)白血病 K562/ADM耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)及 P27 和 P170 蛋白表達(dá)的影響， 探討其可能作用機(jī)制。方法 選用補(bǔ)骨脂素、 苦參堿、 槲皮素、 姜黃素、 川芎嗪、 大黃酸6種中藥單體成分作為研究對(duì)象， MTT比色法測(cè)定 6 種中藥成分對(duì) K562/ADM耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用， 高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素的質(zhì)量濃度， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) K562/ADM耐藥細(xì)胞中 P27 和 P170 蛋白表達(dá)。 結(jié)果 6 種中藥活性成分逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)在 6.99 ～10.59 之間，K562/ADM耐藥細(xì)胞中阿霉素積累比率為 （11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8）； 對(duì)照組 P27 和 P210 蛋白的表達(dá)率分別為（33.1 ±2.1） 和 （6.51 ±1.33）， K562/S 和 K562/ADM耐藥細(xì)胞的 P27 和 P210 相關(guān)蛋白表達(dá)率分別在 （54.2 ±3.5）～ （72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48） 之間。 結(jié)論 6 種中藥活性成分具有不同程度的逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞作用， 且影響耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物質(zhì)量濃度； 各中藥活性成分具有不同程度抑制 K562/ADM耐藥細(xì)胞中 P27 蛋白表達(dá)作用。

補(bǔ)骨脂素； 苦參堿； 槲皮素； 姜黃素； 川芎嗪； 大黃酸； K562/ADM耐藥細(xì)胞； P27； P170； 蛋白表達(dá)

化學(xué)藥物是治療白血病方法之一，但由于白血病細(xì)胞的耐藥性，常限制化療療效，并導(dǎo)致治療失敗。白血病藥物多藥耐藥機(jī)制形成較復(fù)雜，目前雖探討較多但還 未 完全明晰［1-3］； 本 實(shí) 驗(yàn)選用 K562/ ADM耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象， 開展中藥活性成分對(duì)其耐藥逆轉(zhuǎn)影響評(píng)價(jià)以及其對(duì)耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度影響，探索其對(duì)耐藥細(xì)胞 P27 和 P170 蛋白表達(dá)影響以說明其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

選取白血病 K562/S （敏感株） 和 K562/ADM（耐藥阿霉素 K562 細(xì)胞株）， 購(gòu)買于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 小牛血清及 RPMI-1640 培養(yǎng)液由 GIBCO公司出品， 批號(hào) 20120320； 破膜液 A和 B由北京阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20120122。 選擇 6 種中藥活性成分 （補(bǔ)骨脂素、 川芎嗪、苦參堿、姜黃素、槲皮素、大黃酸）做為實(shí)驗(yàn)受試物， 受試物純度 99.9%， 于中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買的對(duì)照品。參考以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)道受試物的使用質(zhì)量濃度為 30 μg/mL［4-5］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 各受試物對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制作用 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 K562/S 和 K562/ADM耐藥細(xì)胞數(shù)分別以0.5 ×105個(gè)/mL和 1 ×105個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板， 在 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)條件下 100 μL/孔接種12 h 后， 分別加入上述受試物和阿霉素共 100 μL，在調(diào)零組和對(duì)照組分別加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，除調(diào)零組外，細(xì)胞培養(yǎng) 72 h 后加 5 mg/mLMTT 20 μL，再培養(yǎng)4 h，傾出培養(yǎng)液，加 DMSO 100 μL/孔， 溶解后用酶標(biāo)儀 （奧地利 TZCAN公司生產(chǎn)） 讀取吸光度 A值 （波長(zhǎng)570 nm）， 取 A值均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率， 并求出半數(shù)抑制質(zhì)量濃度 （ IC50），實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次， 逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù) =K562/ADM耐藥株對(duì)照組 IC50/用藥組 IC50。

2.2 高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素質(zhì)量濃度參考文獻(xiàn) ［6］ 實(shí)驗(yàn)方法， 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期白血病K562/S 敏感株和 K562/ADM耐藥細(xì)胞株， 在培養(yǎng)液中分別加或不加 30 μmol/L的各中藥單體成分補(bǔ)骨脂素、苦參堿、槲皮素、姜黃素、川芎嗪、大黃酸， 再加 5 mg/L的阿霉素， 培養(yǎng)3 h 后收集細(xì)胞，PBS 洗滌重懸計(jì)數(shù)后置 -20 ℃冰箱保存， 測(cè)定前先溶化并超聲處理， 離心 30 min， 取上清進(jìn)樣高效液相色譜 （ 安捷倫 1100 型）； 色譜 C18柱， 流動(dòng)相為 55%乙腈， 體積流量 1 mL/min， 柱溫 35 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng) 290 nm，取樣 10 μL進(jìn)樣分析。 以阿霉素對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)，色譜峰的峰面積對(duì)阿霉素的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸， 其線性回歸曲線為 y=0.081x+ 0.31 （r=0.996， n=5）； 細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累比率 =合用中藥活性成分細(xì)胞內(nèi)阿霉素質(zhì)量濃度/單用阿霉素后細(xì)胞內(nèi)阿霉素質(zhì)量濃度。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定耐藥細(xì)胞 P27 和 P170 蛋白表達(dá) 采用 PBS 液重懸白血病 K562/ADM 耐藥細(xì)胞， 細(xì)胞數(shù)為 1 ×106個(gè)/mL，取 50 μL細(xì)胞液加入 100 μL破膜液 A后，加入 2mL PBS， 離心后棄上清， 加 100 μL破膜液 B及 RD公司抗體 P27（SC-1641） 和 AB-CAM公司 P170 抗體 （110917）5 μL， PBS 液 洗滌 離 心 后加 入 5 μL FITC標(biāo) 記 二抗， 反 應(yīng) 15 min 后 PBS 液 洗 滌 離 心， 450 μL 1%多聚甲醛固定 30 min 后， 上 機(jī)流式細(xì) 胞 儀 （ 美 國(guó)BD公司） 檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各受試物對(duì)白血病 K562/ADM耐藥的細(xì)胞毒作用 6 種受試中藥活性物的質(zhì)量濃度為 30 μg/mL， 與阿霉素合用對(duì)白血病 K562/ADM耐藥株的 IC50在 45.6 ～69.9 ng/mL之間， 相應(yīng) K562/S敏感株的 IC50在 4.7 ～7.9 ng/mL范圍， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表1。

表1 受試物的細(xì)胞毒作用Tab.1 Cytotoxicity of each trail drug

3.2 各受試物對(duì) K562/ADM耐藥細(xì)胞內(nèi)阿霉素質(zhì)量濃度和 P27、 P170 蛋白表達(dá)影響 各受試物對(duì)K562/ADM耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)在 6.99 ～10.59 之間， K562/ADM 耐 藥 細(xì) 胞 中 阿 霉 素 積 累比 率 在（11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8） 之間；對(duì)照組 P27和 P210 蛋白表達(dá)率百分比分別為 （33.1 ±2.1） 和（6.51 ±1.33），相應(yīng) K562/ADM耐藥細(xì)胞 P27 和P210 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 率 分 別 為 （54.2 ±3.5） ～（72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48）之間， 結(jié)果見表2 ～4。

表 2 各中藥成分對(duì) K 562/ADM 耐藥細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累比率和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)影響Tab.2 Influence of herb's active constituents on accumulation and reversal rates of adriam ycin in K562/ ADM strain

表 3 各中藥成分對(duì) K 562/ADM 耐藥細(xì)胞內(nèi) P27 蛋白表達(dá)影響Tab.3 Influence of herb's active constituents on K562/ ADM cells and exPression of P27

表 4 各中藥成分 對(duì) K562/ADM 耐藥 細(xì) 胞內(nèi) P170 蛋白表達(dá)影響Tab.4 Influence of herb's active constituents on K562/ADM drug resistance strain and exPression of P170

4 討論

白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的多重耐藥是導(dǎo)致化療失敗的常見因素，目前認(rèn)為多種作用機(jī)制是白血病細(xì)胞多重耐藥形成原因， 包括細(xì)胞膜 P-糖蛋白 （P-gP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白 （MRP） 過度表達(dá)形成藥物外輸泵， 使化療藥物在白血病細(xì)胞內(nèi)濃度下降［7-9］。

近年來，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路成為多重耐藥形成機(jī)制研究熱點(diǎn)， 其中 PI3K/Akt（phosphatidylinositol-3’ kinase/Akt） 是體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在維持細(xì)胞的正常生理功能如生長(zhǎng)、分化、代謝等方面起著關(guān)鍵作用， PI3K/Akt與腫瘤的 發(fā)生有些密切的關(guān)系，其中在某些白血病細(xì)胞中其表現(xiàn)為持續(xù)性 的 活化［10-11］。 PI3K/Akt信 號(hào)通路的 激 活可引起一系列的生物效應(yīng)，如凋亡效應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、 促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移、 促進(jìn)血管形成等， PI3K/ Akt信號(hào)通路主要通過磷酸化作用激活，活化的Akt還與細(xì)胞周期有關(guān)， 活化的 Akt使 P27 蛋白表達(dá)迅速下降， P27 蛋白是 CDK2 （ cyclin-de-pendent kinase2） 的抑 制 劑， 是一種細(xì) 胞 周 期調(diào) 節(jié) 激 酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞 進(jìn) 入 S 期 中起 抑 制 作用［12-13］；本 實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)表明， K562/ADM 耐藥細(xì)胞 P27 蛋白表達(dá)較K562/S 明顯降低， 同時(shí)各受試物能提高 P27 蛋白的表達(dá)率，因而也提示各受試物具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用可能通過影響 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而達(dá)到的。

P170 是多藥耐藥基因產(chǎn)物， 是多藥耐藥基因編碼的跨膜蛋白，是導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生多重耐藥的原因之一， 具有 ATP酶活性及其轉(zhuǎn)運(yùn)功能， 可將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)排出，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)化療濃度降低，改善白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥［14］， 本研究結(jié)果中K562/ADM耐藥細(xì)胞的 P170 高表達(dá)， 說明了 P170對(duì)耐藥形成的意義； 通過不同受試物對(duì) K562/ADM耐藥細(xì)胞的 P170 蛋白表達(dá)率影響結(jié)果看，苦參堿、姜黃素和川芎嗪各組與對(duì)照組比較具有非常顯著性差異 P＜0.01， 而其他幾種受試物對(duì) K562/ADM耐藥細(xì)胞的 P170 蛋白影響不明顯，同時(shí)與耐藥逆轉(zhuǎn)作用呈非正相關(guān)，就 P170 蛋白表達(dá)是否為其作用機(jī)制因素之一還有待今后進(jìn)一步深入分析。

本實(shí)驗(yàn)是以往就補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、姜黃素、槲皮素、大黃酸等中藥活性成分對(duì) K562 和 HL-60白血病細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞影響的確切結(jié)果基礎(chǔ)上開展的［2，15］， 以往的結(jié)果給本實(shí)驗(yàn)提供了劑量依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步開展了其他中藥活性成分研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示了具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用的不同中藥活性成分對(duì) P27 和 P120 蛋白影響規(guī)律并不完全一致， 該結(jié)果對(duì)探索不同中藥活性成分對(duì) PI3K/Akt信號(hào)通路影響及其作用靶點(diǎn)和機(jī)制研究提供基礎(chǔ)，其具體其他可能機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討說明。

［ 1 ］ Biedler JL.Genetic aspects ofmultidrug resistance［J］ .Cancer， 1992， 70（S6）： 1799-1809.

［ 2 ］ 成志勇， 梁文同， 底勝峰.PTEN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤的多藥耐藥［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志， 2009， 16（4）： 413-417.

［ 3 ］ Grandage V L， Gale R E， Linch D C， etal.PI3-kinase/Akt is constitutively active in primary acutemyeloid leukemia cellsand regulates survivaland chemo resistance via NF-kappa B， MAPK and p53pathways［ J］ .Leukemia， 2005， 19（4） ： 586-594.

［4］ 蔡 宇， 蔡天革， 余紹蕾.基于聚類分析對(duì)中藥活性成分逆轉(zhuǎn) HL60/HTM耐藥性評(píng)價(jià)研究［J］.中成藥， 2010， 32（3）： 379-382.

［ 5 ］ 蔡天革， 蔡 宇， 陳 冰.補(bǔ)骨脂素對(duì) HL60/HT耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用及對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響［J］.中草藥，2006， 37（6）： 881-884.

［ 6 ］ 陳劍鴻， 夏培元， 王章陽(yáng)等.高效液相色譜法測(cè)定 U87 細(xì)胞內(nèi)外液中的阿霉素含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2010，29（5）： 353-356.

［ 7 ］ KasimirBauer S， Beelen D， Flasshove M， et al.Impact of the expression of P glycoprotein， themultidrug resistance-related protein， bcl-2， mutantp53 ， and heat shock protein 27 on response to induction therapy and long-term survival in patientswith de novo acutemyeloid leukemia［ J］.Exp Hematol， 2007，30（11）： 1302-1308.

［8］ 張 慧，符立梧.多藥耐藥相關(guān)蛋白及其在腫瘤耐藥中的作用［ J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 46（5） ： 479-486.

［ 9 ］ Bellarosa C， Bortolussi G， Tiribelli C.The role of ABC transporters in protecting cells from bilirubin toxicity［ J］ .Curr Pharm， 2009， 15 （25）： 2884-2892.

［10］ Zhang H， Bajraszewski N， Wu E， et al.PDGFRs are critical for PI3K/Akt activation and negatively regulated by mTOR［ J］ .JClin Invest， 2007， 117（3） ： 730-738.

［11］ 陳 曦， 王 晗， 歐陽(yáng)學(xué)農(nóng)， 等.PI3K/Art信號(hào)通路活化在曲妥珠抗耐藥機(jī)制意義的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013， 29（4）： 568-573.

［12］ Chu I， Sun J， Arnaout A， et al.P27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclinE-Cdk2 ［ J］ .Cell， 2007， 128（2）： 281-94.

［13］ 韓秋森， 劉曉秋， 韓 英.脈沖磁場(chǎng)對(duì)白血病細(xì)胞 HL60/ ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2009，9（1）： 1-4.

［14］ 李益清， 尹松梅， 謝雙鋒， 等.丙戊酸對(duì) HL-60/HT細(xì)胞P27 Kip1、 P170 表達(dá)水平及耐藥性的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 29（3）： 423-427.

［15］ 蔡 宇， 余紹蕾， 陳 冰.中藥活性成分逆轉(zhuǎn) K562/ADM耐藥性聚類模糊研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志， 2006， 41（13）：971-973.

Influences of six herbal constituents on Protein exPressions of P27 and P170 and reversal of K 562/ADM cells

CHEN Chao1， CAITian-ge2， ZHANG Rong-hua3， YANG Li3， CAIYu3*
（1.The First Affiliated Hospital to Jinan University， Guangzhou 510630， China； 2.School of Life Science of Liaoning University， Shenyang 110036，China； 3.School of Pharmacy of Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AIM To observe the influence of six herbal constituents， including psoralen，matrine， quercetin，curcumin igustrazine and rhein， on leukemia K562/ADM cells reversion and P27 and P170 protein expressions. M ETHODS MTT colorimetric was used to determine proliferation inhibition of six constituents on K562/ADM cells.HPLCmethod was used to detect the concentration ofadriamycin in the cells， and flow cytometrywasapplied to detecting P27 and P170 protein expression of K562/ADM cells.RESULTS The reverse ratio of drug resistance fell within 6.99 to 10.59， adriamycin accumulation in K562/ADM cells in multiples of（ 11.6 ±3.7 ） ～（17.7 ±2.8）， and P210 and P27 protein expression rate of control groups reached （33.1 ±2.1） and （6.51 ± 2.1）.K562/S， K562/ADM cells’ P27 and P210 related protein expression rates were in the range of（54.2 ± 3.5）to（72.1 ±4.2）and （6.21 ±1.35） to（6.59 ±1.48）.CONCLUSION Six herbal constituents have different abilities to reverse drug resistant cell function， to influence on chemotherapy drug concentration in the cell，and to inhibit P27 protein expression in K562/ADM.

psoralen；matrine； quercetin； curcumin igustrazine；rhein； K562/ADM； P27； P170； protein expression

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.001

2013-02-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助 （81072763）

陳 超 （1972—）， 男， 碩士， 主治醫(yī)師， 從事中藥藥效基礎(chǔ)與臨床研究。

*通信作者： 蔡 宇 （1972—） ， 男， 博士， 教授， 從事腫瘤多藥耐藥研究。 E-mail： caitiange@163.com