摘 要 建立了高效液相色譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物（3-甲基喹噁啉-2-羧酸，MQCA）的方法。樣品用乙酸乙酯提取、磷酸鹽緩沖液萃取、鹽酸酸化、乙酸乙酯反萃取，反相色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。喹乙醇代謝物在0.005～1.0 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為1.0000，檢出限為0.14 μg/kg，定量限為0.46 μg/kg?；厥章试?8.5%～85.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.33%～2.34%。優(yōu)化方法后，平均回收率提高24.9個(gè)百分點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；水產(chǎn)品；喹乙醇代謝物；優(yōu)化方法

中圖分類(lèi)號(hào)：S912；O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2014）34-55-04

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喹乙醇（N-羥乙基-3-甲基-乙-喹啉-1，4-二氧化物）是一種化學(xué)合成抗菌促生長(zhǎng)劑，用作飼料添加劑，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸[1]作用，對(duì)人也有致畸形、致突變、致癌的危害，《中國(guó)獸藥典》（2005版）有明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）為喹乙醇主要代謝物，是國(guó)家食品法典委員會(huì)認(rèn)定的標(biāo)示殘留物。

常用MQCA的檢測(cè)方法是高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。雖然LC-MS/MS法提高了定性、定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，但儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，很多區(qū)縣質(zhì)檢機(jī)構(gòu)和小型檢測(cè)機(jī)構(gòu)不具備條件，仍只好采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)參照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008（水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定）[2-3]，在允許偏離的基礎(chǔ)上改進(jìn)方法，提高回收率，為第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和其他實(shí)驗(yàn)研究機(jī)構(gòu)提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑

MQCA標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%），德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

乙酯乙酯、甲醇為色譜純，美國(guó)霍尼韋爾；甲酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，成都科龍?jiān)噭?/p>

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽的配制：稱(chēng)取12.0 g磷酸二氫鈉和14.2 g磷酸氫二鈉，加水溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，加水定容至1000 mL。

1.2儀器、設(shè)備

安捷倫高效液相色譜儀1200，配可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；

分析天平：感量0.00001 g，賽多利斯BT25S；

天平：感量0.01 g，丹弗儀器TP-202；

高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)THERMO Biofuge Stratos；

漩渦混合器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

樣品制備：取新鮮的鰱魚(yú)肌肉，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，混勻后用小型絞肉機(jī)制樣。

提?。悍Q(chēng)取5.00 g樣品于50 mL離心管子中，加20.0 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩5 min，8000 r/min離心8 min，上清液倒入150 mL分液漏斗中。再加20.0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并上清液于150 mL分液漏斗中。再加15.0 mL磷酸鹽緩沖液于離心管中，漩渦振蕩5 min，10000 r/min離心15 min，上清液倒入之前的150 mL分液漏斗中，振蕩分液漏斗1 min，靜置分層，下層收集到另一50 mL離心管子中。

凈化：向離心管中加260 μL濃鹽酸，振蕩充分混勻后，加15.0 mL乙酸乙酯，蓋上蓋子，振蕩提取10 min，10000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入150 mL平底燒瓶中。再加15 mL乙酸乙酯萃取1次，合并上清液到150 mL平底燒瓶中，濃縮后用甲醇—1%甲醇（V/V=45/55）定容至5 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾頭，上機(jī)測(cè)定。

1.4上機(jī)條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；

柱子：ZORBAX SB-C18 4.6×250 mm，5 μm；

柱溫箱：40℃；

流動(dòng)相：甲醇、1%甲醇之比為45∶55，流速1 mL/min；

進(jìn)樣量：50 μL；

保留時(shí)間：7.595 min。

2結(jié)果與分析

2.1MQCA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品譜圖

譜圖見(jiàn)圖1（A、B、C）。

2.2樣品分析和回收率實(shí)驗(yàn)

鰱魚(yú)空白樣品中未檢出喹乙醇代謝物（MQCA）。向鰱魚(yú)空白樣品添加 0.08 mg/kg，0.2 mg/kg，0.8 mg/kg三個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)6個(gè)平行，分別按優(yōu)化方法和標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)?；厥章屎途芏纫?jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，優(yōu)化條件后平均回收率比標(biāo)準(zhǔn)方法提高24.9個(gè)百分點(diǎn)，精密度也提高了。

2.3喹乙醇代謝物（MQCA）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

對(duì)0.005， 0.01， 0.05， 0.25， 0.5， 1.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析，按其所得峰面積與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。MQCA在0.005～1.0 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=93.740x+0.0721， 相關(guān)系數(shù)為1.0000。

2.4檢出限和定量限

根據(jù)檢測(cè)限（LOD）測(cè)定信噪比應(yīng)大于3，定量限（LOQ）測(cè)定信噪比大于10的原理，計(jì)算檢出限為0.14 μg/kg，定量限為0.46 μg/kg，比標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法檢測(cè)限（4 μg/kg）更低，能滿足國(guó)內(nèi)水產(chǎn)品中MQCA的檢測(cè)要求。

2.5方法優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)施初期，按照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008標(biāo)準(zhǔn)（水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測(cè)定）的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，回收率較低。因此，在該標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了方法優(yōu)化，優(yōu)化條件見(jiàn)表2。

采用表2的優(yōu)化主要是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)中勻漿的操作會(huì)損失部分肉質(zhì)和藥物；增加乙酸乙酯和磷酸鹽緩沖液的用量是為了能更充分地提取MQCA；增加鹽酸的用量是將磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至酸性，促進(jìn)酸化，MQCA充分被乙酸乙酯萃?。辉龃箅x心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間是為了更好地除去雜質(zhì)。從表1可知，改進(jìn)方法后，平均回收率可提高24.9個(gè)百分點(diǎn)。

凈化操作中吸取離心后的上層乙酸乙酯時(shí)要盡量吸取，但不要將下面的水層吸到，否則在減壓濃縮時(shí)不能濃縮干，影響定容體積，還會(huì)在上機(jī)時(shí)明顯增高雜質(zhì)峰峰高，加寬目標(biāo)峰峰寬，且重復(fù)性較差。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)前人關(guān)于水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物（MQCA）殘留量的檢測(cè)方法進(jìn)行探討，在農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有采用蛋白酶酶解、固體萃取[4-9]等復(fù)雜、高成本的操作，而是采用萃取、離心等簡(jiǎn)單的操作，具有回收率較高、成本低、操作簡(jiǎn)便、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可為第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和其他實(shí)驗(yàn)研究機(jī)構(gòu)檢測(cè)喹乙醇代謝物提供參考。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）