李傳峰，陳宗艷，孟春春，梁瑞英，胡 文，劉光清

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

密碼子優(yōu)化型鴨甲肝病毒VP1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

李傳峰，陳宗艷，孟春春，梁瑞英，胡 文，劉光清

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了提高基因A型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）VP1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平, 本研究根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性對野生型DHAV VP1（wtVP1）基因進(jìn)行改造, 合成了optiVP1基因，并利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了重組桿狀病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1, 分別轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)VP1蛋白。轉(zhuǎn)染72 h后，sf9細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）, Western-blot和間接免疫熒光法（indirect immunof uorescence assay，IFA）檢測結(jié)果表明VP1蛋白在重組桿狀病毒感染的sf9昆蟲細(xì)胞中獲得了良好表達(dá)。用Image J軟件對 Western-blot掃描的圖片進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，optiVP1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于wtVP1。本研究為進(jìn)一步研制診斷抗原和新型基因工程疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

鴨甲肝病毒； VP1；重組桿狀病毒；密碼子優(yōu)化

根據(jù)國際病毒學(xué)分類委員會2012年發(fā)表的最新病毒學(xué)分類第9次報告，鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）目前是小RNA病毒科（Picornaviridae）、禽肝病毒屬（Avihepatovirus）的唯一成員[1]。DHAV主要包括3個基因型或血清型，即基因A、B和C型或血清1、2和3型[2,3]。其中，基因A型（或血清1型）DHAV為呈世界性分布的經(jīng)典毒株[4-6]；基因B型（或血清2型）DHAV僅出現(xiàn)中國的臺灣地區(qū)[7]；基因C型（或血清3型）DHAV主要分布于韓國和中國大陸[2,3,8,9]。DHAV能引起雛鴨的一種急性高度致死性傳染病，即鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis, DVH），主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，特別是1周齡以下的雛鴨最易感，死亡率可達(dá)到90%以上，嚴(yán)重危害了養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。

基因A型DHAV基因組是一種單股正鏈RNA分子（+ssRNA），全長約7.7 kb，僅含有一個大的開放閱讀框（open reading frame, ORF），編碼一條由2249個氨基酸組成的多聚蛋白前體。多聚蛋白前體在病毒自身編碼蛋白酶的作用下裂成3個結(jié)構(gòu)蛋白（VP0、VP3和VP1）和多個非結(jié)構(gòu)蛋白[4,6]。在小RNA病毒中VP1蛋白作為主要的宿主保護(hù)性蛋白，編碼主要的抗原位點(diǎn)并具有主要的型特異性中和位點(diǎn)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[10]。因此，VP1蛋白可作為研制新型疫苗和診斷抗原的候選分子，具有較重要的學(xué)術(shù)價值和現(xiàn)實意義。同時，由于VP1蛋白分子暴露于病毒粒子的表面，極易發(fā)生變異，導(dǎo)致出現(xiàn)新血清型的DHAV。而且A型DHAV經(jīng)過雞胚傳代后可得到具有良好免疫原性而無致病性的弱毒株，VP1蛋白C端氨基酸序列發(fā)生了較為一致的突變，這表明VP1可能與病毒的致病性密切相關(guān)[11-13]。因此，VP1是研究DHAV致病機(jī)理的最重要靶基因之一。

由于缺乏有效的細(xì)胞培養(yǎng)體系，目前VP1相關(guān)研究僅局限于序列分析[11,13,14]、原核表達(dá)以及相關(guān)的應(yīng)用[15,16]。原核表達(dá)的局限性限制了對VP1蛋白更為深入和全面的研究。本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)，利用Bac-to-Bac昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在sf9細(xì)胞中表達(dá)DHAV VP1蛋白時，表達(dá)量偏低影響了實驗效率。為了提高DHAV VP1蛋白的表達(dá)量，本研究根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏愛性，在不改變野生型VP1基因（wtVP1）編碼氨基酸的基礎(chǔ)上設(shè)計并合成了優(yōu)化型VP1基因（optiVP1），分別構(gòu)建了含有wtVP1和optiVP1基因重組桿狀病毒，并分析兩者在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的差異，為進(jìn)一步研制診斷抗原和新型基因工程疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒（菌）株、細(xì)胞、質(zhì)粒和載體 鴨甲肝病毒ZJ-V株（GenBank登錄號：EF382778）、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和E.coliDH10Bac、昆蟲細(xì)胞系sf9和pFast-DHAV重組質(zhì)粒均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病研究室保存；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1購自Invitrogen公司。

1.1.2 工具酶和試劑 LATaq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、dNTP均購自TaKaRa寶生物工程（大連）公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；SF-900II SFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、Grace’s培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II Reagent均購自Invitrogen公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗DHAV VP1多克隆抗血清由本實驗室制備和保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計和基因合成 根據(jù)GenBank中登錄的基因A型DHAV全基因組序列（登錄號：EF382778），設(shè)計特異擴(kuò)增VP1基因的引物。上游引物P1：5'-AAACTGCAGATGGGTGATT CTAACCAGTTGG-3'，下游引物P2：5'-CGG GGTACCCTATTCAATT TCCAGATTGAG-3'，在上下游引物的5'端分別加入PstⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線所示）以及相應(yīng)的保護(hù)性堿基，擴(kuò)增目的片段大小為714 bp。根據(jù)Bac-to-Bac昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊，設(shè)計1對通用引物以驗證目的基因是否重組到桿狀病毒上，上游引物M13up: 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'，下游引物M13down: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。以上引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將A型DHAV的VP1基因全部密碼子按照昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，并將該基因兩端分別引入PstⅠ和KpnⅠ兩個酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的VP1基因（optiVP1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成并重組至pFastBac1載體上，獲得質(zhì)粒pFast-optiVP1。

1.2.2 基因A型DHAV VP1基因的擴(kuò)增 以pFast-DHAV重組質(zhì)粒為模板，用設(shè)計合成的特異性引物P1和P2進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)的條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.3 重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將DNA凝膠回收試劑盒回收的PCR產(chǎn)物和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別用PstⅠ和KpnⅠ雙酶切、膠回收、連接和轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取單一菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽性克隆子，經(jīng)過雙酶切鑒定后送樣測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFastwtVP1。同時將合成的pFast-optiVP1重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.4 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 分別將pFast-wtVP1和pFast-optiVP1轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)4 h后，取100 μL涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（7 μg/mL）、四環(huán)素（10 μg/mL）以及X-gal（100 μg/mL）和IPTG（20 μg/mL）的LB平板上。37 ℃避光培養(yǎng)48 h后，挑取白色菌落，在同樣含有上述3種抗性的LB平板上進(jìn)行2次篩選，挑取白色菌落搖菌。按照Bac-to-Bac昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊提取重組Bacmid質(zhì)粒，分別用M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定，同時設(shè)立Bacmid空質(zhì)粒作為對照。鑒定為陽性的重組桿粒分別命名為rBacmid- wtVP1和rBacmid- optiVP1。

1.2.5 重組桿狀病毒的拯救 參考Cellfectin Reagent說明書進(jìn)行操作。在重組桿粒rBacmid-wtVP1、rBacmid-optiVP1和轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II Reagent中分別加入100μL Grace’s培養(yǎng)基（不含胎牛血清和抗生素）混勻后，轉(zhuǎn)染試劑混合物分別與前兩者混合均勻，室溫孵育45 min，分別制成rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1脂質(zhì)體。取生長良好的sf9單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液；用新的Grace’s培養(yǎng)基洗2次，將rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1脂質(zhì)體分別覆蓋細(xì)胞，28 ℃孵育5 h；棄去殘留的脂質(zhì)體混合物，加入Grace’s完全培養(yǎng)基（含胎牛血清和抗生素），28℃繼續(xù)孵育至70%～80%細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，300×g離心15 min，上清即為原代毒種（P1代），4 ℃避光保存?zhèn)溆?。將P1代毒種在sf9昆蟲細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng)1次后即為P2代毒種，以此類推。同時轉(zhuǎn)染Bacmid空質(zhì)粒作為陰性對照。

1.2.6 重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定 用P3代毒種接種對數(shù)生長期sf9細(xì)胞，72 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入適當(dāng)體積的PBS重懸細(xì)胞沉淀，超聲裂解后加入等體積的2×SDS loading buffer（100 mmol/L Tris-HCl pH8.0、200 mmol/L巰基乙醇、4%SDS、2%溴酚藍(lán)和20%甘油）?；靹颍≈蠓? min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以同樣處理的正常昆蟲細(xì)胞作為陰性對照。電泳分離后，以10V的恒壓將目的蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，PBST洗膜后用5%的脫脂乳于37 ℃封閉30 min，然后加入兔抗DHAV VP1多克隆抗血清（1:100），37 ℃作用2 h；PBST洗滌3次，5 min/次，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:2000），37 ℃作用1 h，充分洗滌后，DAB顯色和拍照。

1.2.7 重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光（indirect immunofluorescence, IFA）鑒定 將感染后72 h的sf9細(xì)胞用PBST洗滌3次，以固定劑（4%甲醛）于常溫下固定細(xì)胞約20 min。棄去固定液，PBST洗滌3次，自然干燥后加入兔抗VP1多克隆抗血清（1:100），37 ℃作用2 h。PBST洗滌3次，5 min/次，然后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200），37 ℃作用1 h。PBST充分洗滌4～5次后，熒光顯微鏡下觀察熒光反應(yīng)。同時設(shè)置正常和感染野生型桿狀病毒的sf9細(xì)胞作為對照。

2 結(jié)果

2.1 VP1的擴(kuò)增和穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而獲得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可得到大小約為714 bp左右的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A）。將獲得的PCR產(chǎn)物克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1，制備的重組質(zhì)粒以及人工合成的重組質(zhì)粒pFast-optiVP1經(jīng)過PstⅠ和KpnⅠ雙酶切和測序鑒定均表明，VP1基因片段插入方向和閱讀框正確（圖1B）。

圖1 VP1基因的PCR擴(kuò)增(A)和重組穿梭質(zhì)粒的酶切鑒定(B)Fig.1 Amplif cation of VP1 gene by PCR (A) and identif cation of recombinant transfer plasmids by restriction analysis(B)

2.2 重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將pFast-wtVP1和pFast-optiVP1轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，發(fā)生位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)過3抗LB平板（50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG）藍(lán)白斑篩選，得到白色陽性菌落。陽性菌落用mini-attTn7位點(diǎn)外的M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增可出現(xiàn)大小約3000 bp的條帶，分別命名為rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1，而野生型桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid僅出現(xiàn)大小約為273 bp的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

2.3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞將重組桿狀病毒質(zhì)粒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞5 d后，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變大、變圓，細(xì)胞核增大甚至充滿整個胞漿，核內(nèi)有包涵體樣、折光性差的顆粒，呈現(xiàn)顆粒狀細(xì)胞逐漸崩解，漂浮于培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染野生型桿粒Bacmid也可產(chǎn)生類似病變，而未轉(zhuǎn)染的sf9細(xì)胞形態(tài)完整，生長正常（圖3）。

圖2 重組桿狀病毒質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identif cation of recombinant bacmid by PCR amplif cation

圖3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后的細(xì)胞病變(200×)Fig.3 Cytopathic effects of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus (200×)

2.4 重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測對重組桿狀病毒在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組桿粒Bacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1的sf9細(xì)胞裂解產(chǎn)物均在大約27 kDa出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶，與預(yù)期大小一致，而轉(zhuǎn)染野生型桿粒Bacmid的sf9昆蟲細(xì)胞以及正常sf9昆蟲細(xì)胞在此位置均未出現(xiàn)目的條帶（圖4A）。用Image J軟件對 Western-blot掃描的圖片進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的VP1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于野生型VP1基因，大約提高2倍（圖4B）。

2.5 重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的IFA檢測將P3代重組桿狀病毒以及野生型桿狀病毒感染sf9昆蟲細(xì)胞，于27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后進(jìn)行IFA檢測。檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了重組桿粒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1的sf9昆蟲細(xì)胞中均可見到特異的綠色熒光，而且兩者相比，轉(zhuǎn)染了重組桿粒rBacmid-optiVP1的昆蟲細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量明顯更多。而轉(zhuǎn)染了野生型桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞和正常昆蟲細(xì)胞均未出現(xiàn)熒光。

圖4 Western-blot檢測VP1蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Western-blot analysis of VP1 protein expression in insect cells

圖5 間接免疫熒光法（IFA）檢測DHAV VP1蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Identif cation of DHAV VP1 protein expression in insect cells by indirect immunof uorescence assay

3 討論

VP1蛋白作為DHAV最重要一種抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，因此在DHAV的流行病學(xué)調(diào)查以及和新型疫苗的研發(fā)中具有重要作用[15,17]。目前對A型DHAV VP1蛋白的重組表達(dá)多利用原核表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用研究也局限于血清學(xué)診斷法的建立[15,16]。原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、生產(chǎn)周期短，成本低、表達(dá)量高且易于純化等顯著特點(diǎn)，但表達(dá)產(chǎn)物缺乏翻譯后的修飾，多以無生物活性的包涵體形式存在[18]。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，有其自身獨(dú)特的優(yōu)勢[19-21]，主要表現(xiàn)在具備真核細(xì)胞完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力，因此表達(dá)的蛋白具有良好的生物活性；宿主范圍狹窄，僅限于昆蟲，對哺乳動物和禽類等脊椎動物具有較高安全性。此外，它還具有基因體外重組所需時間短，陽性重組率高的特點(diǎn)，重組體不需要蝕斑純化即可獲得，這大大提高了工作效率和經(jīng)濟(jì)效益。因此，該系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種功能蛋白或病毒樣顆粒（virus like particles, VLP）的表達(dá)[22-25]。為了獲得更接近天然構(gòu)象和生物活性的蛋白，本研究選擇了Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在sf9細(xì)胞中表達(dá)DHAV VP1蛋白。

本實驗在前期研究中發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中時表達(dá)量偏低，不足以用于進(jìn)行診斷試劑和亞單位疫苗的研制。已有的研究成果已經(jīng)表明，不同種類生物或同種生物不同組織器官對密碼子的使用頻率是不同的，優(yōu)勢密碼子與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)[26]。宿主細(xì)胞對密碼子的偏愛性，經(jīng)常影響外源基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)效率[27]。換言之，通過密碼子優(yōu)化的策略可以顯著提高外源基因的表達(dá)水平。Chen等[28]在不改變小鵝瘟病毒 VP2蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上根據(jù)昆蟲細(xì)胞的偏愛性優(yōu)化了VP2基因，顯著提高了其在昆蟲細(xì)胞上的表達(dá)量，并形成了病毒樣顆粒。Cao等[29]曾利用Bac-to-Bac昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)成功表達(dá)了Asia I型口蹄疫病毒的VLPs，而不能表達(dá)O型口蹄疫病毒的VLPs，然而優(yōu)化O型口蹄疫病毒衣殼蛋白編碼基因后也成功表達(dá)并形成了VLPs。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，DHAV VP1基因能夠在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)但是表達(dá)量偏低。通過與宿主昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者密碼子偏愛性存在較大的差異（結(jié)果未顯示）。這可能是降低VP1基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)量的主要原因。因此，本研究根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏愛性優(yōu)化了DHAV VP1基因，使其更利于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。研究結(jié)果也證實，密碼子優(yōu)化的策略的確提高了VP1基因在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)量。雖然本研究未進(jìn)行定量分析，但是根據(jù)Western-blot以及IFA結(jié)果仍能很容易判斷密碼子優(yōu)化的VP1基因要明顯高于野生型VP1基因的表達(dá)水平，而且也表明了VP1蛋白具有良好的抗原性。

總之，本研究在不改變基因A型DHAV VP1蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過密碼子優(yōu)化策略使其能在昆蟲細(xì)胞中得到更為高效的表達(dá)，為進(jìn)一步建立檢測DHAV的血清學(xué)方法以及新型基因工程疫苗奠定了堅實基礎(chǔ)。

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ENHANCED EXPRESSION OF CODON-OPTIMIZED VP1 GENE OF DUCK HEPATITIS A VIRUS IN INSECT CELLS

LI Chuan-feng, CHEN Zong-yan, MENG Chun-chun, LIANG Rui-ying, HU Wen, LIU Guang-qing
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the present study was to enhance expression level of VP1 gene of Duck hepatitis A virus (DHAV) genotype A in insect cells by manipulating the codon usage bias. The codon usage of wild-type DHAV VP1 (wtVP1) gene was optimized and designated as optiVP1. The recombinant rBacmid-optiVP1 and rBacmid-wtVP1 plasmids were then constructed using the Bac-to-Bac baculovirus expression system (BEVS) and then transfected to sf9 insect cells at logarithmic phase for expression of VP1 protein. The typical cytopathic effect was observed in sf9 cells at 72 h post transfection. The expression of VP1 protein in sf9 cells was conf rmed in Western blotting and indirect immunof uorescence assay (IFA). The VP1 amounts on Western blotting were measured using the software Image J. The expression level of optiVP1 gene was signif cantly increased as compared with wtVP1 gene. This study provided a basis for development of diagnostic reagents and genetically engineered novel vaccines for DHAV.

Duck hepatitis A virus; VP1; recombinant baculovirus; codon optimization

S852.659.6

A

1674-6422（2014）01-0001-08

2013-10-30

國家自然科學(xué)基金項目（31101848）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項（2012JB13）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003012）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）項目（2011AA10A200）

李傳峰，男，博士，助理研究員，主要從事水禽病毒病分子生物學(xué)研究

劉光清，E-mail: liugq@shvri.ac.cn