米立娟，張守峰，劉 曄，王述超，扈榮良

（軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，長春 130122）

狂犬病病毒磷蛋白單抗的制備與應(yīng)用

米立娟，張守峰，劉 曄，王述超，扈榮良

（軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，長春 130122）

以滅活的狂犬病病毒CVS株細胞毒免疫BALB/c小鼠，通過間接ELISA法和Western-blot篩選獲得針對磷蛋白的單克隆抗體4株：1C9、4B10、2G12 、4G5，其中1C9針對氨基端保守表位。以親和層析法純化1C9單抗腹水，異硫氰酸熒光黃標記制備熒光抗體。以1C9磷蛋白熒光抗體與本實驗室研制的狂犬病核蛋白免疫熒光抗原檢測試劑盒，對本實驗室收集的501份疑似狂犬病鼬獾、蝙蝠、犬和黃鼬的腦組織樣品進行直接免疫熒光平行檢測。結(jié)果顯示，兩種檢測手段對基因1型狂犬病毒的檢出結(jié)果完全一致，而蝙蝠源Irkut病毒僅能以磷蛋白單抗1C9檢出。本研究成功獲得了與我國現(xiàn)有不同基因型狂犬病毒良好反應(yīng)的抗狂犬病磷蛋白單抗，并應(yīng)用于狂犬病的直接免疫熒光檢測，為狂犬病診斷提供了敏感性和可靠性良好的診斷試劑。

狂犬病病毒；磷蛋白單克隆抗體；熒光抗體

狂犬?。╮abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)導致的致死性的人獸共患傳染病?？袢〔《緸閺棤畈《究疲≧haboviridae）、狂犬病毒屬（Lyssaavirus）成員，含有5種結(jié)構(gòu)蛋白，分別編碼核蛋白（nuclear protein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、糖蛋白（glycoprotein，G）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）和RNA聚合酶（RNA polymerase，L）。

狂犬病磷蛋白基因由894個核苷酸組成，編碼297個氨基酸。在細胞中，通過核糖體滲漏掃描，P基因可以編碼P1、P2（起始于20位氨基酸）、P3（起始于53位氨基酸）、P4（起始于69位氨基酸）、P5（起始于83位氨基酸）5種蛋白[1,2]。由于這五種蛋白氨基端核定位信號序列長度不一樣，導致他們在細胞中的分布不同，從而行使不同的功能[3]。同時，近年來，科學家對RV磷蛋白功能的研究更加深入，Brzó zka等[4,5]發(fā)現(xiàn)磷蛋白可以阻斷干擾素誘導因子3和7（IRF3/IRF7）的磷酸化及二聚化，進而阻斷宿主干擾素信號通路，還可以通過阻止STAT1/STAT2向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移阻斷1型干擾素信號通路。同時，狂犬病病毒磷蛋白結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，在細胞中的表達量僅次與核蛋白，因此，研制一種有效的RV磷蛋白單抗，對于研究狂犬病病毒各蛋白的功能及狂犬病病毒感染的診斷都有重要實際應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒種與主要試劑RV弱毒株SRV9及強毒細胞適應(yīng)株CVS-11、BHK-21細胞、小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）由本室保存；PEG4000、HRP標記的羊抗鼠二抗、RPMI-1640購自GIBCO BRL公司；HAT、HT、弗氏不完全佐劑與弗氏完全佐劑等購自Sigma公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自PERSEN公司；IgG親和純化試劑nProte in A SepharoseTM 4 Fast Flow購自Pharmacia公司；DMSO為SERVA 公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級。

1.2 小鼠免疫和雜交瘤細胞的建立用RV SRV9株腦毒，初免疫BALB/c小鼠（購自長春生物制品研究所實驗動物中心），再用本室CVS-11細胞毒，超速離心后進行免疫。免疫程序如下：一免，100 μL 106TCID50的毒與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，乳化，腹腔注射；二免、三免，取等量的病毒與等體積的弗氏不完全佐劑充分混合，每隔2周免疫1次；最后一次免疫3周后，再取300 μL等滴度病毒不加佐劑進行加強免疫，3 d后，取脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合；細胞融合與篩選按常規(guī)方法進行[6]，經(jīng)4輪細胞克隆并對細胞克隆上清進行ELISA檢測：CVS-11細胞毒作為陽性抗原，空白細胞為陰性抗原包被96孔酶標板，細胞克隆上清為一抗，HRP標記的羊抗鼠抗體為二抗。待陽性孔率達到100%時，對獲得的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，收集上清，細胞液氮凍存。

1.3 腹水制備基本步驟包括，利用滅菌液體石蠟腹腔注射BALB/c小鼠0.5 mL/只；取106個細胞/0.5 mL注入小鼠腹腔；2周左右腹腔明顯膨大時，抽取腹水。

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 單克隆抗體的亞型鑒定 按照單克隆抗體亞型鑒定試劑盒操作說明書，對得到的單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.4.2 免疫印跡（Western-blot）分析 參照文獻[7, 8]方法，用蛋白裂解液收集RV感染BHK-21細胞的蛋白為抗原，收集的未感染BHK-21細胞為陰性對照，在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，經(jīng)半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；以純化的腹水分別為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行免疫印跡反應(yīng)分析。

1.5 抗體的純化、熒光標記及熒光抗體工作濃度測定照Pharmac ia試劑說明，以親和層析凝膠純化小鼠腹水內(nèi)抗體IgG，按文獻[8]方法進行抗體的FITC 熒光標記。標記好的熒光抗體，以直接免疫熒光法[9]在接CVS-11毒株的BHK-21細胞上確定其工作濃度。

1.6 病料檢測參照直接免疫熒光法[10]對犬27份、鼬獾292份、蝙蝠104份、黃鼬78份病料進行檢測，同時用狂犬病核蛋白免疫熒光抗原檢測試劑盒進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞的獲得與腹水的制備用狂犬毒強毒株CVS-11免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合后，細胞上清經(jīng)間接ELISA檢測，獲得4株穩(wěn)定分泌抗RV抗體的雜交瘤細胞，分別命名1C9、4810、2G12、4G5。這4株雜交瘤細胞經(jīng)過擴增，注射小鼠腹腔；待小鼠腹部脹大，用5 mL注射器每3 d抽取1次腹水。腹水經(jīng)10 000×g4 ℃離心10 min，取上清，于-80 ℃儲存。

2.2 單抗亞型鑒定亞型鑒定結(jié)果顯示，上述4株單抗均為IgG，其中的1C9株為IgG2a亞型。

2.3 單克隆抗體的Western-blot分析Western-blot分析表明，1C9株、4B10株單抗與RV反應(yīng)只有1條40 kDa帶；2G12株、4G5株單抗與RV反應(yīng)有5條帶，其中1條為40 kDa與磷蛋白大小一致，在26～34 kDa之間有3條帶。這4株單抗均不與未感染RV的BHK-21細胞反應(yīng)（圖1）。

2.4 熒光抗體標記及工作濃度以親和層析法對制備的小鼠腹水進行IgG 純化，經(jīng)SDS-PAGE 電泳證實，純化產(chǎn)物僅呈現(xiàn)兩條電泳帶，即IgG 重鏈和輕鏈。每1 mL腹水純化后的IgG 溶于3 mL PBS緩沖液內(nèi)，經(jīng)FITC 標記后，加終濃度為0.04%的疊氮鈉防腐，4 ℃保存。經(jīng)直接免疫熒光測定，該批次熒光抗體的工作濃度為1:900。染毒前后BHK-21細胞的直接免疫熒光檢測效果見圖2。

圖1 4株單抗腹水分別與RV的Western-blot分析Fig.1 Western-blot analysis on monoclonal antibody reactivity to RV

圖2 病毒感染BHK-21細胞的直接免疫熒光結(jié)果Fig. 2 DFA result of BHK-21 cells infected or not infected with RV

2.5 病料檢測結(jié)果磷蛋白熒光抗體按1:900的工作濃度，對犬27份、鼬獾292份、蝙蝠104份、黃鼬78份病料進行檢測；同時，狂犬病核蛋白免疫熒光抗原檢測試劑盒對同批樣品進行了檢測，結(jié)果見表1。

表1 DFA在疑似病料中檢測結(jié)果Table 1 The results of RV in tissues samples by DFA

3 討論

本實驗獲得的這4株雜交瘤細胞都是針對狂犬病毒磷蛋白的單克隆抗體。通過Western blot分析可知，這4株單抗均與RV感染細胞反應(yīng)，而與不感染RV的細胞均不發(fā)生反應(yīng)。其中1C9株、4B10株單抗與RV反應(yīng)只有1條約40 kDa帶，2G12株、4G5株單抗與RV反應(yīng)有5條帶，這與Chenik等[2]報道的狂犬病病毒磷蛋白多翻譯起始現(xiàn)象一致。

狂犬病病毒磷蛋白基因在細胞中，利用核糖體滲漏掃描（leaky-scanning）可翻譯出5種蛋白（p1、p2、p3、p4及p5），起始氨基酸位置分別為aa1、aa20、aa53、aa69和aa83[1,2]。DNAMAN軟件預(yù)測，全長磷蛋白（p1）可能存在13個抗原表位，分布圖3。

圖3 P蛋白抗原表位預(yù)測圖譜結(jié)果Fig. 3 Prediction result of antigenic epitopes for P protein

通過Western-blot分析可知，這4株單抗均與RV感染細胞反應(yīng)，而與不感染RV的細胞均不發(fā)生反應(yīng)。其中1C9株、4B10株單抗與RV反應(yīng)只有1條約40 kDa帶，故這兩株單抗識別的抗原表位在aa1到aa20之間，即上圖第一個抗原表位，此時，這兩株單抗在蛋白印跡試驗中只能識別p1，顯示1條條帶；2G12株、4G5株單抗與RV反應(yīng)有5條帶，故其識別的抗原表位在aa83之后，這些抗原表位可同時識別p1、p2、p3、p4及p5，顯示5條條帶，其中第4條與第5條條帶因大小接近，在蛋白印跡試驗圖片中肉眼不可區(qū)分。

RV的結(jié)構(gòu)蛋白中，磷蛋白的遺傳穩(wěn)定性較強，不同毒株之間抗原表位的同源性也較高[10]，氨基酸同源為在92%～98%。因此選用磷蛋白的單克隆抗體，作為熒光抗體檢測的工具，具有良好的特異性。

以1C9磷蛋白熒光抗體與本實驗室研制的狂犬病核蛋白免疫熒光抗原檢測試劑盒對本實驗室收集的501份疑似狂犬病鼬獾、蝙蝠、犬和黃鼬的腦組織樣品進行直接免疫熒光平行檢測，結(jié)果顯示，兩種檢測手段對基因1型狂犬病毒的檢出結(jié)果完全一致。其中本試驗的1C9熒光抗體從蝙蝠樣品中檢測出1份陽性，核蛋白熒光抗體試劑盒檢測全是陰性。檢測出的這份陽性樣品經(jīng)證實是國內(nèi)分離到的第1株非RV狂犬病毒[11]，該毒株屬于彈狀病毒科，狂犬病毒屬，Irkut病毒種。該毒株具有致人感染死亡的毒力，因此及時準確地對該毒株進行檢測是十分必要的。

核蛋白熒光抗體是目前應(yīng)用與抗原檢測比較常見的，但是目前它不能診斷檢測出Irkut病毒；本試驗制備的磷蛋白熒光抗體不但與核蛋白熒光抗體的檢出結(jié)果一致，而且能檢測出Irkut病毒，說明該熒光抗體可能成為一種良好的檢測病毒抗原的工具。為了避免以后對狂犬病病原的漏檢，可以將核蛋白熒光抗體與磷蛋白熒光抗體混合一起，共同對狂犬病毒進行檢測，這樣可以更準確的檢測出狂犬病病毒，提高檢測準確率。

[1] Chenik M, Chebli K, Blondel D. Translation initiation at alternate in-frame AUG codons in the rabies virus phosphoprotein mRNA is medited by a ribosomal leaky scanning mechanism[J]. J Virol,1995, 69(2): 707-712.

[2] Chenik M, Chebli K, Blondel D. Translation Initiation at Alternate In-Frame AUG Codons in the Rabies Virus Phosphoprotein mRNA Is Mediated by a Ribosomal Leaky Scanning Mechanism.[J]. J Virol, 1995, 69(2): 707-712.

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PREPARATION OF MOUSE ANTI-RABIES VIRUS PHOSPHOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES AND APPLICATION

MI Li-juan, ZHANG Shou-feng, LIU Ye, WANG Shu-chao, HU Rong-liang
(Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Institute of Military Veterinary, AMMS, Changchun 130122, China)

Four monoclonal antibodies against Rabies virus phosphoprotein were produced by immunization with Rabies virus strain CVS in BALB/c mice. After fusion, antibodies in the supernatant of the hybrid cells were respectively detected by ELISA test and western-blot method. Four hybrid cells secreting antibody binding to rabies virus , i.e. 1C9, 4B10, 2G12 and4G5 strains. The 1C9 monoclonal lgG antibody was purif ed by aff nity chromatography method and then labeled with FITC. 501 brain samples collected from ferret badgers, bats, dogs and weasels were detected using the labeled 1C9 antibody and FITC-labeled rabies virus N protein-specif c monoclonal antibody (made in our laboratory). The results showed that the labeled 1C9 antibody can detect rabies-related lyssaviruses isolated in China including Rabies virus and Irkut virus, however, the N protein-specif c monoclonal antibody only can detect Rabies virus. It suggests that the labeled 1C9 antibody can be used as a rabies diagnostic reagent in China.

Rabies virus; phosphoprotein; monoclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2014）01-0025-05

2013-8-11

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)項目資助（201203056）

米立娟，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學專業(yè)

扈榮良， E-mail：ronglianghu@hotmail.com