徐志威，杜保偉，熊明國(guó)*

（1.河南省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校夏邑分校，河南商丘 476400；2.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘 476400）

桃豫農(nóng)矮砧 1 號(hào)外植體滅菌方法的研究

徐志威1，杜保偉2，熊明國(guó)2*

（1.河南省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校夏邑分校，河南商丘 476400；2.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘 476400）

[目的]為桃豫農(nóng)矮砧1號(hào)愈傷組織的培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。[方法]試驗(yàn)通過(guò)75%乙醇與升汞、次氯酸鈉、消毒片的不同濃度不同時(shí)間組合對(duì)桃豫農(nóng)矮砧1號(hào)葉片滅菌效果的比較，探討合理有效的滅菌方法。[結(jié)果]結(jié)果表明，75%乙醇與不同濃度的消毒片混合使用的滅菌效果要明顯好于75%乙醇與其他滅菌劑混合使用的滅菌效果。其中以75%乙醇滅菌30 s，5.0 g/L消毒片處理8 min效果最好。[結(jié)論]桃豫農(nóng)矮砧1號(hào)外植體滅菌以75%乙醇滅菌30 s，5.0 g/L消毒片處理8min效果最好。

桃；矮化砧木；升汞；次氯酸鈉；消毒片

桃（Prunus persica）又名普通桃，屬于薔薇科（Rosaceae）桃屬桃亞屬（Subgen．Amygdalus）植物。在果樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體的滅菌是愈傷組織培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)[1]。桃樹(shù)為多年生植物，經(jīng)常遭受內(nèi)部和外部的微生物侵染，使得從成熟植株上獲得的外植體較難消毒。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者們很少對(duì)桃樹(shù)外植體滅菌進(jìn)行研究[2-3]。污染問(wèn)題是一大難題，造成污染的原因有很多，可能是外植體帶菌、用具滅菌不徹底、操作人員不遵守操作規(guī)程等。在果樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中，預(yù)防污染是一項(xiàng)艱難而重要的工作，需要消耗大量的人力、物力[4-5]。為了減少損失、提高效率，必須在各個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生?；诖耍撛囼?yàn)就桃豫農(nóng)矮砧1號(hào)葉片，使用不同滅菌試劑和不同滅菌時(shí)間組合，對(duì)滅菌效果進(jìn)行篩選，以期找到效果較好的組合，為矮化砧木愈傷組織的培養(yǎng)打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用桃豫農(nóng)矮砧1號(hào)的葉片，取材時(shí)間為晴天上午10：00左右，取材部位樹(shù)冠中下層生長(zhǎng)健壯枝條先剪下枝條，然后回到實(shí)驗(yàn)室從上往下數(shù)第5～7片葉子剪下用于試驗(yàn)。經(jīng)滅菌后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種后進(jìn)行觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2 方法

試驗(yàn)選用乙醇、升汞、次氯酸鈉和愛(ài)爾施牌消毒片（有效氯50 mg/g）4種滅菌劑。首先用剪刀將葉片從枝條上剪下來(lái)，帶一定長(zhǎng)度的葉柄，再用洗潔精水浸泡0.5 h。然后置超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌水沖洗2次后，再將葉片放置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗5遍，再用不同的滅菌劑按不同的濃度和滅菌時(shí)間組合對(duì)其滅菌。不同滅菌方法設(shè)置12個(gè)處理（表1），初步判斷出滅菌效果后針對(duì)某種滅菌劑設(shè)置9個(gè)處理（表2），經(jīng)滅菌后接種于初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光/暗周期是16/8 h。培養(yǎng)7 d后觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)污染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑處理對(duì)外植體污染率的影響

不同滅菌劑的處理效果方差分析見(jiàn)表1。從污染率來(lái)看，消毒片滅菌后污染率明顯低于其他滅菌劑，0.2%HgCl2滅菌3 min的處理和5%NaClO滅菌10 min處理，0.1%HgCl2滅菌3 min處理與3%NaClO滅菌10 min處理，0.1%HgCl2滅菌5 min處理和5% NaClO滅菌5 min處理之間的方差分析效果不顯著，3%NaClO滅菌5 min和其他處理差異顯著，消毒片不同濃度、不同時(shí)間組合的處理之間差異顯著，其中6.0 g/L消毒片滅菌10 min的處理污染率最低，同時(shí)顯著差異于其他處理，為最佳處理組合。

表1 不同滅菌劑的滅菌效果

2.2 消毒片不同處理對(duì)外植體污染率的影響

消毒片不同濃度與不同時(shí)間組合的滅菌效果見(jiàn)表2。從污染率來(lái)看，4.0 g/L消毒片處理的污染率明顯高于5.0和6.0 g/L消毒片處理，5.0 g/L消毒片中5 min處理與8 min處理和10 min處理差異顯著，8 min處理和10 min處理差異不顯著，但整體來(lái)說(shuō)低于5min的處理，6.0 g/L消毒片中8 min處理與5 min處理和10 min處理之間差異顯著，5 min處理和10 min處理之間差異不顯著，但整體效果低于8 min處理。綜上分析，5.0 g/L消毒片8 min處理、5.0 g/L消毒片10 min處理、6.0 g/L消毒片5 min處理和6.0 g/L消毒片10 min處理的整體污染率也是最低，但方差分析結(jié)果差異不顯著，綜合考慮高濃度的消毒劑對(duì)外植體處理的毒害作用和外植體在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)狀態(tài)，最終確定最適的滅菌組合為處理17○，即5.0 g/L消毒片處理8 min。

表2 消毒片不同滅菌方法的滅菌效果

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)不同滅菌劑不同時(shí)間組合處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可以看出，使用75%乙醇與消毒片不同濃度、不同時(shí)間組合的滅菌效果明顯好于其他的滅菌劑組合。方差分析效果顯示，6.0 g/L消毒片10 min處理組合的污染率最低，顯著低于其他處理，為最佳處理組合。在分析出消毒片的滅菌效果后又設(shè)置了消毒片不同濃度、不同時(shí)間組合的處理，從中發(fā)現(xiàn)5.0 g/L消毒片和6.0 g/L消毒片的處理效果明顯優(yōu)于4.0 g/L消毒片的處理效果。通過(guò)方差分析并綜合考慮消毒對(duì)外植體的影響，得出結(jié)論，以75%乙醇滅菌30 s+5.0 g/L消毒片8 min處理污染率最低，為16.67%，滅菌效果最好。

[1]吳延軍，徐昌杰，張上隆.桃組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀及展望.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2002，19（2）：123-127.

[2]周玉碧.桃高效微繁體系的建立與遺傳穩(wěn)定性研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[3]李浚明，朱登云.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版利，2005.

[4]尚敏克，姜國(guó)斌，伊偉倫，等.晚熟桃的離體組織培養(yǎng)[J].遼寧林業(yè)科技，2002（3）：5-7.

[5]劉進(jìn)平，莫饒.熱帶植物組織培養(yǎng)[M].科學(xué)出版社，2006.

（責(zé)任編輯 張楊林）

Research on Disinfection Methods of Prunus persica Dwarf Yunong Rootstock No.1

XU Zhi-weiet al.(Xiayi Angeles,Henan Province Agricultural Broadcasting and Television School, Shangqiu,Henan 476400)

[Objective]The aim was to establish the base of the induction of callus in Prunus dwarf rootstock No.1.[Method]The stem segments of thePrunus persicadwarf Yunong rootstock No.1 was disinfected by 75% ethanol and different concentrations different time combination of HgCl2,NaClO,disinfection piece in order to seek the effective disinfection method.[Result]The results indicated that the disinfection effect of treatment 75%ethanol and disinfection piece was better than the mixture of 75%ethanol and others.The best method was used 75%ethanol 30 s+5.0 g/L disinfection piece 8 min.[Conclusion]The best disinfection method of dwarf Prunus Yunong rootstock No.1 was used 75%ethanol 30 s+5.0 g/L disinfection piece 8 min.

Peach;Dwarf rootstock;HgCl2;NaClO;Disinfection piece

S188

A

2095-0896（2014）12-033-02

徐志威（1973-），男，河南夏邑人，農(nóng)藝師，從事農(nóng)村農(nóng)業(yè)技術(shù)教育研究。*通訊作者，講師，碩士，從事果樹(shù)生物技術(shù)研究，E-mail：xmg7501@163.com。

2014-12-14