曾 香綜述,金玉姬審校

(吉林醫(yī)藥學院：1.2010級預(yù)防醫(yī)學本科班，2.基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

胚胎干細胞的研究進展

Research progress of Embryonic stem cells

曾 香1綜述,金玉姬2*審校

(吉林醫(yī)藥學院：1.2010級預(yù)防醫(yī)學本科班，2.基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

胚胎干細胞是來源于胚胎內(nèi)細胞團的具有多向分化潛能的一類干細胞，自從20世紀70年代開始研究胚胎干細胞以來，已經(jīng)廣泛用于生命科學的許多領(lǐng)域。本文綜述了近些年關(guān)于胚胎干細胞建系、分化和應(yīng)用的研究進展，同時也指出了目前所面臨的問題。

胚胎干細胞;臨床應(yīng)用;研究進展

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESC)是一種從早期胚胎的囊胚內(nèi)細胞團細胞或胎兒原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)中經(jīng)分離、體外抑制分化培養(yǎng)得到的具有發(fā)育全能性(或多能性)的一類干細胞。與已經(jīng)成熟分化的體細胞一樣，ES細胞也是一分為二地分裂增殖，且ESC具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定的培養(yǎng)條件下，ES細胞可以在體外長久和穩(wěn)定地自我復(fù)制，實現(xiàn)“永生”。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)、中、外3個胚層的幾乎所有類型細胞。因此，ES細胞成為研究哺乳動物早期胚胎發(fā)生、細胞組織分化、基因表達調(diào)控等發(fā)育生物學基礎(chǔ)研究的一個非常理想的模型系統(tǒng)和非常有用的工具，也是進行動物胚胎工程開發(fā)和用于治療各種疾病，修復(fù)受損傷的組織和器官的一個重要途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。1999年，《Science》將干細胞研究評為21世紀最重要的10項研究領(lǐng)域之首，ES細胞的建立、研究和應(yīng)用被認為是繼“人類基因組計劃”之后，醫(yī)學、生命科學上的又一革命性進展。

1 ES細胞的基本概念及其研究歷史

胚胎干細胞研究的起源來自20世紀70年代對畸胎瘤的研究：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠體內(nèi)后產(chǎn)生了畸胎癌(即惡性的畸胎瘤)，畸胎癌內(nèi)的細胞(即EC，胚胎癌細胞)能在體外自我更新且能分化成不同種類的細胞，由于這種類型的畸胎癌只能由著床前的早期小鼠胚胎產(chǎn)生，因此推測EC細胞的來源是胚胎發(fā)育早期短暫出現(xiàn)的外胚層細胞(epiblast)。關(guān)于EC細胞的研究使科學家認為可能從小鼠早期胚胎中分離到一種能分化成多種細胞的具有全能性的干細胞，即胚胎干細胞(ESC)。2001年美國國立衛(wèi)生院根據(jù)Austin Smith對小鼠ES細胞的研究，對其概念提出了一系列標準[2]。自從1981年Evans和Kaufman從延緩著床的小鼠囊胚內(nèi)細胞團(ICM)中分離出胚胎干細胞后，全球就掀起了胚胎干細胞研究的熱潮。1998年，美國威斯康星大學的Thomson教授在建立靈長類動物胚胎干細胞系的基礎(chǔ)上，建立了人類胚胎干細胞系(hES);同年，另一研究小組用流產(chǎn)胎兒性腺成功地分離和培養(yǎng)并建立了人胚胎生殖細胞(embryonic germ cells,EG細胞)系[2]。國內(nèi)在細胞胚胎干方面的綜合性研究雖然起步較晚(1989年)，但發(fā)展非常迅速。在基礎(chǔ)研究方面，尚克剛、賴學良等已先后建立了小鼠和兔細胞系，盛惠珍研究小組在國際上首次構(gòu)建了人-兔核移植重構(gòu)胚。在應(yīng)用研究方面，竇忠英的科研小組已第6次從人類胚胎干細胞中分化誘導(dǎo)得到心臟跳動樣細胞團，中國軍事醫(yī)學科學院發(fā)現(xiàn)了“人胚胎干細胞素”，用于臨床多種疾病的治療取得了明顯效果[3]。

2 ES細胞的基本特性

ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細胞體積小，核大，核質(zhì)比高，有一個或多個明顯的核仁，核型正常，具有整倍性。在體外分化抑制性生長時，ES細胞呈克隆狀生長，排列緊密，呈鳥巢集落狀，難以看清細胞界限，集落邊界清晰，有立體感。用堿性磷酸酶染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。小鼠ES細胞的直徑為7～18 μm，豬、牛、羊ES細胞的顏色較深，直徑為12～18 μm[4]。

ES細胞具有全能性、無限增殖性、種系傳遞功能，ES細胞易于進行基因改造操作，并保留了正常二倍體的性質(zhì)且核型正常，能參與胚胎各組織器官的生長發(fā)育等生理功能[4]。

ES細胞表面表達時相專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen，SSEA)，而且可以檢測到Oct-4基因的表達，這兩種蛋白為發(fā)育全能性的標志。另外，ES細胞中AFP及端粒酶活性較高，可用于ES細胞分化與否的鑒定。hES細胞表達以下所有分子標志物有Oct3/4、TDGF、Sox2、LeftyA、Thy-1、FGF4、Rex1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-2-54和GCTM-2,這些分子標志物在未分化的hES細胞中高表達，在分化細胞中不表達或低表達[5]。

3 ES細胞的建系與培養(yǎng)

ES細胞建系，來自由分離的內(nèi)細胞群細胞、從5～9周的胚胎生殖腺中分離ES細胞。也用克隆技術(shù)將體細胞核移植到去核卵母細胞中，使之發(fā)育成囊胚，再分離其內(nèi)細胞群細胞，由這種方法獲得的細胞或組織，遺傳物質(zhì)和供體一致，故移植后不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，Hwang等[6]應(yīng)用這種方法獲得了胚胎干細胞。1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES細胞系，在此之后近20年里，人們相繼自早期胚胎建立了倉鼠、豬、兔、水貂、大鼠、魚類、鳥類、牛、靈長類動物(恒河猴、狨)和人的類ES細胞系。從PGCs分離克隆到小鼠EG細胞系后，人們分別自PGCs分離克隆到人、山羊、雞等類ES細胞[2]。

目前建立的hES細胞株主要來源于臨床進行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的患者捐贈的多余廢棄的新鮮或冷凍解凍后的胚胎。首先需去除囊胚的透明帶，常規(guī)的方法為鏈蛋白酶消化；然后去除外圍的滋養(yǎng)細胞層，可用機械法或利用補體介導(dǎo)的免疫手術(shù)法分離內(nèi)細胞團；最后將完整的內(nèi)細胞團接種在小鼠胚胎成纖維細胞(primary mouse embryo fibroblast，PMEF)飼養(yǎng)層上，后者一般用絲裂霉素處理或放射線照射的方法使其失去增殖能力。一段時間的培養(yǎng)后，hES細胞從內(nèi)細胞團中長出來，形成集落樣的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過反復(fù)傳代，建成hES 細胞系[7]。

ES細胞需要特殊的培養(yǎng)基。常用改良伊格爾培養(yǎng)基(MEM)α、達氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)、組織培養(yǎng)基(TCM)199、F12等合成培養(yǎng)基。飼養(yǎng)層細胞能向培養(yǎng)液中分泌多種細胞因子，在一定程度上影響并調(diào)節(jié)細胞的生長。如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等細胞分化抑制因子和成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子等促有絲分裂因子。培養(yǎng)ES細胞常用的飼養(yǎng)層有STO、SNL(G418R基因和LIF基因轉(zhuǎn)染的STO)、HBC5637、小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)等。PMEF與STO細胞一樣也能分泌抑制ES細胞分化的因子LIF，且PMEF與STO細胞相比其形成ES細胞的克隆率、維持ES細胞正常核型的能力及形成嵌合體的能力均比STO細胞要好一些[9]。

hES細胞的培養(yǎng)體系主要分為：含飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法。

小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)是培養(yǎng)hES細胞最常用的飼養(yǎng)層。胎盤來源的飼養(yǎng)層細胞可以很好地支持hES生長并且不需要添加bFGF，這可能與飼養(yǎng)層細胞增強了內(nèi)源性bFGF表達或激活hES的ERK1/2-c-Fos/c-Jun信號通路有關(guān)。流產(chǎn)胎兒的皮膚和肌肉細胞，以及成人輸卵管上皮細胞體外培養(yǎng)后均能夠支持hES細胞的體外擴增，而且他們用人血清代替SR或胎牛血清，用這種新的飼養(yǎng)層細胞建立了一株無動物源性蛋白污染的細胞系，為將來安全的將細胞應(yīng)用于臨床治療帶來了希望。不過，即使是人源飼養(yǎng)層也不能排除異體污染的風險，所有目前的ES細胞還是無法滿足臨床應(yīng)用的要求[11]。

也用PMEF制備的條件培養(yǎng)液和基質(zhì)膠(matri gel，作為貼壁基質(zhì))建立hES的無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系；在培養(yǎng)液中添加TGF、LIF及bFGF，輔助以fibronectin也建立了無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系；還可以通過使用特異性化學藥物激活Wnt信號途徑來維持ES細胞在無飼養(yǎng)層條件下的生長。近年來技術(shù)人員通過研究hES自我更新機制有關(guān)的信號通路開發(fā)出許多無飼養(yǎng)層、無異源污染的培養(yǎng)液，這些培養(yǎng)液中包含一些激活干細胞自我更新通路或抑制其分化的重組生長因子。目前已經(jīng)有較多商業(yè)化的無飼養(yǎng)層、無異源污染的成分明確的培養(yǎng)液出現(xiàn)，但是已被報道可用于hES建系的培養(yǎng)液僅有TeSR1，尚處試驗階段未被商業(yè)化[12]。

4 ES細胞的定向分化及其機制

目前所使用的誘導(dǎo)方法主要包括：外源性生長因子誘導(dǎo)ES細胞分化、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細胞分化、ES細胞與其他細胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ESC分化等[13]。

ES細胞可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、滋養(yǎng)層細胞、角化細胞、生殖細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞、肺細胞和胰島細胞等多種細胞類型[14]。

ES細胞的分化受內(nèi)源性因素和外源性因素的共同調(diào)節(jié)。細胞內(nèi)基因表達的調(diào)控作用是ES細胞發(fā)生分化的決定因素，細胞所在的環(huán)境條件對ES細胞的分化也有重要影響。

內(nèi)源性調(diào)控：①基因因素。奢侈基因?qū)毎麤Q定著細胞向特殊類型分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，如編碼肌細胞肌球蛋白基因，編碼結(jié)締組織的膠原蛋白基因等。②細胞蛋白的調(diào)控。細胞的結(jié)構(gòu)蛋白如膜收縮蛋白和細胞周期素A、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、分泌性蛋白質(zhì)Nodal等都是對干細胞自我更新有著重要作用的細胞蛋白。③轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Oct-4和Nanog是兩種維持干細胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，分別與Sox 2、FoxD3等其他轉(zhuǎn)錄因子以及LIF、骨形態(tài)生成蛋白(BMP)等胞外信號通路互相作用，在特異時空激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。

外源性調(diào)控：①分泌因子。間質(zhì)細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖、分化。特別是TGF-β家族和Wnt信號通路在不同組織中都發(fā)揮重要作用；②蛋白信號。有些信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細胞黏附連接的結(jié)構(gòu)成分，穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細胞分化有重要影響，變異的組蛋白H2AZ在染色質(zhì)功能的發(fā)育過程中是一個關(guān)鍵的調(diào)控因子，對基因表達等功能起重要的作用。③細胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用。細胞外起介導(dǎo)作用的物質(zhì)包括細胞外基質(zhì)、黏附分子、激素和細胞因子等[2]。

5 ESC的應(yīng)用

ES細胞及其體外分化模型能夠模擬胚胎正常發(fā)育進程，在發(fā)育生物學、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)、克隆動物、動物和人類疾病模型的建立、藥物的開發(fā)和篩選、基因治療、細胞組織和器官的修復(fù)和移植治療等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。

5.1 研究胚胎發(fā)育及疾病的發(fā)生

許丹等證明用ES細胞培養(yǎng)體系對小鼠的早期胚胎進行培養(yǎng),可以顯著提高小鼠早期胚胎的發(fā)育率[15]。還可以通過胚胎干細胞建立體外分化模型，并建立各種基因改變的胚胎干細胞系，以求發(fā)現(xiàn)某些基因或細胞因子在胚胎發(fā)育早期對不同類型細胞或組織分化的作用。hES細胞可用于研究人胚的早期發(fā)育,因為早期人胚發(fā)育過程尚不明了,能導(dǎo)致先天性缺陷和胎盤異常而導(dǎo)致流產(chǎn)的事件。研究體外hES細胞，可以鑒定引致這些問題的遺傳學、分子生物學和細胞學事件，并確定如何預(yù)防其發(fā)生。hES細胞也可用于探索胚胎早期發(fā)育中染色體的異常，包括檢測早期兒童腫瘤的發(fā)生[16]。

5.2 用于細胞、組織的修復(fù)和移植治療

ES細胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細胞，因為它具有發(fā)育分化成構(gòu)成機體的所有類型組織細胞的能力，任何因物理、化學或生物因素等造成的細胞損傷或病變引起的疾病都可以通過移植由ES細胞定向分化而來的特異組織細胞或器官來治療[2]。并且，通過控制胚胎干細胞生長環(huán)境、向胚胎干細胞轉(zhuǎn)染某一種系細胞形成的決定基因等，可獲得數(shù)量不受限制的特定種系的較純化的細胞，為細胞移植提供源源不盡的無免疫性的材料。如果這些細胞用于移植治療，將給帕金森氏病、脊髓損傷、糖尿病、心肌損傷、肝硬化、腎衰竭、各種血液疾病等疑難病癥的治療帶來新的希望[7]。

5.3 用于基因治療

通過將人胚胎干細胞定向誘導(dǎo)分化成所需的細胞、組織、器官，不僅解決了移植材料來源困難問題，又可以對干細胞的基因做某些修改，即破壞細胞中表達組織相容性復(fù)合物的基因，以躲避受者免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而防止免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。另一種克服移植免疫排斥反應(yīng)的設(shè)想是結(jié)合克隆技術(shù)創(chuàng)建患者特異性的干細胞，用這種干細胞培養(yǎng)獲得的細胞、組織或器官，其基因和細胞膜表面的主要組織相容性復(fù)合體與患者的完全一致，不會導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。另外，利用基因打靶技術(shù)使外源性DNA與胚胎干細胞中的相應(yīng)部分重組，或靶向破壞等位基因造成基因純合失效來治療某些遺傳性疾病，具有基因轉(zhuǎn)移效率高、易于操作的優(yōu)點。hES細胞可作為開發(fā)遺傳工程的一種新方法。當前小鼠ES細胞的體外遺傳互補極易通過同源重組技術(shù)實現(xiàn),這是一種替換或添加基因的技術(shù)，它需要人為地將一個DNA分子導(dǎo)入基因組并表達它。利用這一方法，誘導(dǎo)分化成特定類型細胞的基因或表達所需蛋白產(chǎn)物的基因可以被導(dǎo)入ES細胞。如果利用人ES細胞使這一技術(shù)得以開發(fā),則可設(shè)計出基因治療的好方法[18]。

5.4 用于藥物篩選和藥物開發(fā)

新藥在臨床使用前需要進行一系列的檢測和實驗，這些實驗都依靠動物來完成，但是動物模型實驗不可能完全反映藥物對人體細胞的作用。胚胎干細胞能模擬體內(nèi)細胞或組織對被檢測藥物的反應(yīng)，使結(jié)果更接近真實情況，從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟的藥物篩選模型。于洲等對建立的胚胎干細胞神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型的研究證明，其可以作為體外發(fā)育毒性評價方法對神經(jīng)發(fā)育毒物進行篩選。此外，由于ES細胞類似于早期胚胎組織，它還可用來揭示哪些藥物會干擾胎兒的發(fā)育，引起出生缺陷。并且還可利用人胚胎干細胞建立人類疾病模型，在分子水平上研究疾病的發(fā)生機制，幫助尋找更有效的治療方法和藥物[19]。

6 目前存在的問題及展望

在ES細胞的研究中，仍然存在著許多問題，如誘導(dǎo)分化效率低、定向細胞分離和純化困難、培養(yǎng)條件滯后、定向分化的機制、臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因的安全性、交叉污染、免疫排斥等。除這些外，由于ESC涉及早期胚胎，因此由涉及的倫理、社會、法律、醫(yī)學、神學和道德等爭議也限制了當前hES細胞的發(fā)展，不得不引起重視[20]。

近年來的研究顯示，體細胞在四個轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Klf-4、Sox-2和c-Myc的作用下可以重編程為誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。由于人iPSC可以較容易地由個體自身的體細胞經(jīng)誘導(dǎo)獲得，同時避免倫理方面的問題，因此，iPSC被認為是替代ESC的良好材料。為了提高iPS細胞技術(shù)的效率及安全性，研究圍繞著篩選標記、載體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的種類、體細胞類型和一些可以促進效率提高的化合物篩選等展開，目前進展很快。

但是，iPS細胞也存在許多謎團，如iPS細胞其體細胞特異的基因是否完全沉默、重編程的結(jié)果差異和危險性等[21]。希望隨著科技的發(fā)展，科學家們能陸續(xù)解答這些謎團，讓ESC和iPS更好的造福于人類。

[1] 陳展睿.胚胎干細胞的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2012,12(26):5186-5188.

[2] Majumder M A,Cohen C B.Future directions for oversight of stem cell research in the United States:an update[J].Kennedy Inst Ethics J,2009,19(2):195-200.

[3] 徐 蘭,李 斌.人胚胎干細胞建系和培養(yǎng)的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2012,12(32):6393-6398.

[4] Nakamura K,Aizawa K,Yamauchi J,et al.Cell Prolif.Hyperforin inhibits cell proliferation and differentiation in mouse embryonic stem cells[J].Cell Prolif,2013,46(5):529-537.

[5] 蓋 慧,褚建新.人胚胎干細胞建系、培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化研究現(xiàn)狀[J].國際生物醫(yī)學工程雜志,2006,29(4):209-214.

[6] Hwang W S,Ryu YJ,Park J H,et al.Evidence of a pluripotent Human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst[J].Science,2004,303(5664):1669-1674.

[7] Klimanskaya I,Chung Y,Meisner L,et al.Human embryonic stem cells derived without feeder cells[J].Lancet,2005,365(9471):1636-1641.

[8] L?ser P,Schirm J,Guhr A,et al.Human embryonic stem cell lines and their use in international research[J].Stem Cells,2010,28 (2):240-246.

[9] Hasegawa K,Pomeroy J E,Pera M F.Current technology for the derivation of pluripotent stem cell lines from human embryos[J].Cell Stem Cell,2010,6(6):521-531.

[10] Park Y,Choi I Y,Lee S J,et al.Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines,H1 and HSF6,on human placenta derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation[J].Stem Cells Dev,2010,19(11):1713-1722.

[11] Garfield A S.Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures[J].Methods Mol Biol,2010,633:19-27.

[12] Peiffer I,Barbet R,Hatzfeld A,et al.Optimization of physiological xenofree molecularly defined media and matrices to maintain human embryonic stem cell pluripotency[J].Methods Mol Biol.2010,584:97-108.

[13] 鄧守龍,彭 濤,呂自力,等.哺乳動物成體干細胞的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(9):88-93.

[14] Yamash ita A,Takada T,Omatsu-Kanbe M,et al.Monkey embryonic stem cells differentiate into adipocytes in vitro[J].Cloning Stem Cells,2006,8(1):3-9.

[15] 許 丹,蔣曉明,潘增祥,等.胚胎干細胞培養(yǎng)體系對早期胚胎發(fā)育的影響[J].生殖醫(yī)學雜志,2006,15 (3):175-178.

[16] Cooper M.Regenerative medicine:stem cells and the science of monstrosity[J].Med Humanit,2004,30(1):12-22.

[17] Shyh-Chang N,Daley G Q,Cantley L C.Stem cell metabolism in tissue development and aging[J].Development,2013,140(12):2535-2547.

[18] Nouspikel T.Genetic instability in human embryonic stem cells:prospects and caveats[J].Future Oncol,2013,9(6):867-877.

[19] Ellerstr?m C,Strehl R,Hyllner J.Labeled stem cells as disease models and in drug discovery[J].Methods Mol Biol,2013,997:239-251.

[20] Wu D C,Boyd A S,Wood K J.Embryonic stem cell transplantation:potential applicability in cell replacement therapy and regenerative medicine[J].Front Biosci,2007,12:4525-4535.

[21] Knoepfler P S.Deconstructing stem cell tumorigenicity:a roadmap to safe regenerative medicine[J].Stem Cells,2009,27(5):1050-1056.

1673-2995(2014)01-0062-05

吉林省科技發(fā)展計劃項目基礎(chǔ)研究自然科學基金項目(課題號：20130101147JC);吉林省2013年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目.

曾 香(1990-)，女(漢族)，在讀本科.

金玉姬(1965-)，女(朝鮮族)，教授，博士.

R329

A

2013-11-21)