，，，

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 青島 266071)

在世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位[1]。在我國，男性膀胱癌發(fā)病率居全身腫瘤的第8位，女性為第12位[2]。膀胱癌中移行細胞癌最多見，其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，受到廣泛關(guān)注[3]。轉(zhuǎn)移是決定浸潤性膀胱癌的侵襲性及臨床預(yù)后最重要的臨床病理特征，30%的浸潤性膀胱癌病人確診時鏡下已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，超過90%的病人最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移。膀胱腫瘤又為異質(zhì)性腫瘤，TNM系統(tǒng)不能完全評價腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。腫瘤間質(zhì)是腫瘤不可或缺的組成部分，其對腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)控機制一直是腫瘤學(xué)研究的熱點。本研究以膀胱腫

瘤間質(zhì)蛋白作為研究對象，以放射性核素相對標記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ法)獲取腫瘤蛋白表達譜，并與尿液的蛋白質(zhì)表達譜進行比對，探討從尿液中發(fā)現(xiàn)反映膀胱癌惡性轉(zhuǎn)移潛能的生物標記組的可能性。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

按照“知情同意”原則收集高、中、低轉(zhuǎn)移潛能浸潤性膀胱癌標本各10例。病人因浸潤性膀胱癌在我院治療，在泌尿外科行全膀胱切除術(shù)。術(shù)前均未進行化療或放射治療。術(shù)后10 min內(nèi)取腫瘤組織，無菌PBS沖洗后，液氮冷凍保存?zhèn)溆谩吮窘?jīng)兩名副高級以上病理學(xué)專家檢查確診，并根據(jù)回顧性分析中的主流統(tǒng)計學(xué)模型預(yù)測指數(shù)(PI)收集標本，根 據(jù)PI的整體分布將病人的轉(zhuǎn)移風險分為3組。

1.2 激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)切割腫瘤組織

LCM使用PixCell Ⅱlaser capture microdissection system 和CapSure LCM Macrocaps (Arcturus Engineering公司)，按照文獻描述步驟操作。根據(jù)光鏡下樣本情況及獲得最佳捕獲效率設(shè)定儀器參數(shù):Pulse Duratio 2.0 ms，Beam-Diameter 15 μm，Beam Power 70 mW。每例標本捕獲間質(zhì)細胞25 shootings，顯微鏡下檢查切割所獲得的細胞群均具有98%的同源性。

1.3 胰酶蛋白酶酶解蛋白

酶解蛋白質(zhì)混合物及二維液相色譜分離多肽混合物，經(jīng)LCM技術(shù)處理后放入沉淀溶液中,-20 ℃至少12 h。以含體積分數(shù)1.00的丙酮及體積分數(shù)0.70的乙醇沖洗片狀沉淀物，采用Bio-Rad protein assay kit檢測可溶性蛋白質(zhì)濃度。二硫蘇糖醇濃縮可溶性蛋白質(zhì)200 μg，最終濃度為20 mmol/L，然后經(jīng)40 mmol/L碘乙酰胺烷基化。Microcon-10超濾去除甲苯胺藍并且脫鹽后，蛋白質(zhì)混合物中加入測序級胰蛋白酶(蛋白質(zhì)混合物∶測序級胰蛋白酶=1∶30)37 ℃過夜。

1.4 肽段標記

各組樣品分別取100 μg，按照試劑盒iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標記。用iTRAQ溶解緩沖液溶解；隨后分別在iTRAQ試劑115、116和117內(nèi)各加入60 μL無水乙醇,用處理后的iTRAQ試劑115、116和117分別標記高危、中危、低危肽段混合物，室溫條件下反應(yīng)1 h后，把4組標記樣品混合，加入10倍體積的SCX上樣緩沖液。

1.5 SCX分級

取標記后的所有肽段混合，應(yīng)用儀器AKTA Purifier 100(GE Healthcare)進行SCX預(yù)分級。收集穿流及洗脫fraction約30份，根據(jù)SCX色譜圖合并成10份，凍干后C18 Cartridge脫鹽。

1.6 毛細管高效液相色譜

每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。

1.7 質(zhì)譜鑒定

每份樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進行質(zhì)譜分析，按照機器操作步驟說明進行操作。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10個碎片圖譜。采用美國Finnigan公司提供的SEQUEST軟件搜索碰撞誘導(dǎo)裂解后的串聯(lián)質(zhì)譜圖。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI human蛋白庫。

1.8 基因本體論(GO)分析

對我們研究的差異表達蛋白譜進行深入分析，GO蛋白軟件用于GO濃集-缺失表達分析獲得的生物學(xué)數(shù)據(jù)，對于濃縮分析，我們需要一個測試數(shù)據(jù)集和一個GO注釋的包含完整的人類蛋白質(zhì)組的參考集。按照GO網(wǎng)頁上的說明，從EBI GOA 80.0提取出的有關(guān)GO注釋創(chuàng)造出了自定義的GO的參考集。

1.9 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析采用SPSS version 16.0軟件，應(yīng)用卡方檢驗進行比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)鑒定

各組樣本中分別鑒定出蛋白991/964、957/1 022、1 086/979個。為了揭示間質(zhì)細胞的遺傳特點并降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，我們只分析3組樣本中共表達的943個蛋白。差異表達蛋白中的最大和最小相對分子質(zhì)量分別為5 630和629 090，等電位(PI)分布范圍為3.67～11.36。

2.2 蛋白質(zhì)濃集-缺失表達分析

在943個蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細胞成分注解的蛋白質(zhì)分別為760、804個。通過與國際蛋白質(zhì)索引(IPI)的完整列表進行對比，生物學(xué)途徑中濃集-缺失的分支術(shù)語為55/11，細胞成分中濃集-缺失的分支術(shù)語為43/8。

3 討 論

膀胱腫瘤轉(zhuǎn)移潛能存在異質(zhì)性，獲得體現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的細胞純系是進行本研究的關(guān)鍵步驟，為達到此目的，我們實驗第一步采取了LCM技術(shù)，并獲得足量蛋白進行后續(xù)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析。LCM聯(lián)合iTRAQ技術(shù)，最終我們獲得了腫瘤間質(zhì)中943個差異表達蛋白，蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細胞成分注解的蛋白質(zhì)分別為760、804個。其中的部分蛋白已經(jīng)被報道與膀胱癌轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。例如，F(xiàn)SCN1被證實在浸潤性膀胱癌組織標本及相應(yīng)尿液標本中100%過度表達[4]；在高級別及多發(fā)膀胱腫瘤組織中HMOX1 mRNA的表達顯著高于低級別及單發(fā)者，其可作為預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的生物標記[5]；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測膀胱腫瘤組織中蛋白表達情況，ANXA1表達顯著增加，其表達水平與膀胱腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[6]。

既往研究中已經(jīng)證實,腫瘤間質(zhì)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。人原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤和間質(zhì)細胞具有多種異質(zhì)性分泌物，其通過ELR+CXC趨化因子高度分泌，作用于CXCR1和CXCR2，從而影響腫瘤的生長和惡化[7]。葡萄膜黑色素瘤5年病死率高達30%，死因是由于肝臟轉(zhuǎn)移,而腫瘤間質(zhì)高表達PEDF，可抑制小鼠模型肝轉(zhuǎn)移的進展[8]。近期研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌的遠處轉(zhuǎn)移中高表達轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的腫瘤基質(zhì)成纖維細胞分泌白細胞介素11是一個必要的先決條件[9]。本研究通過檢測高、中、低浸潤性膀胱癌間質(zhì)中差異表達的蛋白質(zhì)來判定腫瘤病人轉(zhuǎn)移的風險，為腫瘤的綜合治療提供幫助。

細胞增殖、分化、黏附等相關(guān)蛋白的研究一直是腫瘤研究的熱點，很多蛋白已經(jīng)被驗證同腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，此類蛋白的表達差異決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能，并可以用于評判腫瘤的轉(zhuǎn)移風險。生物學(xué)途徑中，以細胞增殖、細胞分化、細胞黏附及細胞行為為例，對比已發(fā)表文獻，發(fā)現(xiàn)這些蛋白的濃集表達符合惡性腫瘤的生物學(xué)特點。在細胞增殖過程中，PRDX1在膽囊癌組織中表達異常，與膽囊癌進展及預(yù)后關(guān)系密切[10]；在前列腺癌組織中，PEDF通過直接誘導(dǎo)單核細胞或巨噬細胞遷移和分化成m1型細胞而發(fā)揮抗腫瘤作用[11]；KHDR1在鱗狀細胞癌組織中高度上調(diào)，其在膀胱癌的進展中可能發(fā)揮重要作用[12]。歐洲腫瘤實驗中心的癌癥臨床試驗結(jié)果顯示，在33例腫瘤病人中檢測到AINX的表達，其可影響間變性少突膠質(zhì)細胞瘤化療效果并可作為獨立的預(yù)后因素[13]；CALR表達水平的變化可能會影響膀胱癌在體外和體內(nèi)的進展。以RNA和基質(zhì)金屬蛋白酶2、9為檢測目標，以提高常規(guī)尿液細胞學(xué)診斷效能的研究中，MMP9預(yù)測膀胱腫瘤尿細胞學(xué)靈敏度為90%[14]。這些蛋白密切參與了各類腫瘤的生物學(xué)過程，在腫瘤的細胞增殖、分化、黏附過程中發(fā)揮作用，在一定程度決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移風險。

根據(jù)GO細胞組分濃集-缺失分析的定義，濃集的特定蛋白功能活躍，并且該成分的蛋白組更容易通過生物流體研究呈現(xiàn)，更可能被確認為生物標記物。在溶酶體術(shù)語中，已經(jīng)證實乳癌、肺癌和腦癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中各種溶酶體蛋白高度表達，超過正常水平；核內(nèi)體蛋白CATB在腫瘤細胞侵犯質(zhì)膜的過程中可降解層粘連蛋白和基底膜成分，從而促進腫瘤的浸潤[15]。我們研究的結(jié)果表明，特定蛋白在腫瘤的浸潤過程中功能活躍，可用來作為生物標記。

總之，LCM聯(lián)合iTRAQ法分析不同轉(zhuǎn)移潛能浸潤性膀胱癌間質(zhì)蛋白的表達譜特征，結(jié)果可靠、有效。細胞的生物學(xué)途徑和亞細胞結(jié)構(gòu)決定腫瘤轉(zhuǎn)移潛能，并可以成為潛在的可以從尿液中檢出的生物學(xué)標記物。

[參考文獻]

[1]JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2]虞頌庭,臧美孚,夏溟,等. 尿路上皮腫瘤概論[M]//昊階平. 泌尿外科學(xué). 濟南: 山東科學(xué)技術(shù)出版社, 2004:942.

[3]公欣海,王永華,邵世修,等. 膀胱移行細胞癌組織B7-H1和CXCR4表達及其意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2013,28(4):286-288.

[4]MCKNIGHT R, COHEN C, SIDDIQUI M T. Fascin stain as a potential marker of invasiveness in carcinomas of the urinary bladder: a retrospective study with biopsy and cytology correlation[J]. Diagn Cytopathol, 2011,39(9):635-640.

[5]YIM M S, HA Y S, KIM I Y, et al. HMOX1 is an important prognostic indicator of nonmuscle invasive bladder cancer recurrence and progression[J]. J Urol, 2011,185(2):701-705.

[6]LI C F, SHEN K H, HUANG L C, et al. Annexin-Ⅰ overexpression is associated with tumour progression and indepen-dently predicts inferior disease-specific and metastasis-free survival in urinary bladder urothelial carcinoma[J]. Pathology, 2010,42(1):43-49.

[7]ADALSTEINSSON V A, TAHIROVA N, TALLAPRAGADA N, et al. Single cells from human primary colorectal tumors exhibit polyfunctional heterogeneity in secretions of ELR+CXC chemokines[J]. Integr Biol (Camb), 2013,5(10):1272-1281.

[8]YANG H, GROSSNIKLAUS H E. Constitutive overexpression of pigment epithelium-derived factor inhibition of ocular melanoma growth and metastasis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010,51(1):28-34.

[9]VANHARA P, SOUCEK K. Mutual cytokine crosstalk between colon Cancer cells and microenvironment initiates deve-lopment of distant metastases[J]. JAKSTAT, 2013,2(2): e23810.

[10]LI J, YANG Z L, REN X, et al. ILK and PRDX1 are prognostic markers in squamous cell/adenosquamous carcinomas and adenocarcinoma of gallbladder[J]. Tumour Biol, 2013,34(1):359-368.

[11]NELIUS T, SAMATHANAM C, MARTINEZ-MARIN D, et al. Positive correlation between PEDF expression levels and macrophage density in the human prostate[J]. Prostate, 2013,73(5):549-561.

[12]MOREIRA J A, GROMOV P, CELIS J E. Expression of the tumor suppressor protein 14-3-3σ is down-regulated in invasive transitional cell carcinomas of the urinary bladder undergoing epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2004,3(4):410-419.

[13]MOKHTARI K, DUCRAY F, KROS J M, et al. Alpha-internexin expression predicts outcome in anaplastic oligodendroglial tumors and may positively impact the efficacy of chemotherapy[J]. Cancer, 2011,117(13):3014-3026.

[14]EISSA S, BADR S, ELHAMID S A, et al. The value of combined use of survivin mRNA and matrix metalloproteinase 2 and 9 for bladder cancer detection in voided urine[J]. Dis Markers, 2013,34(1):57-62.

[15]TKOTASKA K, DUSEK P, PRUSA R, et al. Urine and se-rum cathepsin B concentrations in the transitional cell carcinoma of the bladder[J]. J Clin Lab Anal, 2012,26(2):61-65.