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(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 胸外科； 2 中心實驗室)

microRNA-451是長約22 nt的內源性非編碼小分子RNA，通過作用于靶mRNA使其降解或抑制其轉錄后翻譯，從而調控基因表達、細胞周期以及細胞的增殖與壞死[1]。蛋白激酶B(P-AKT)是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化的AKT通過磷酸化下游的許多靶蛋白，發(fā)揮其生物學活性，可以調節(jié)基因的轉錄、翻譯以及翻譯后加工，從而調節(jié)細胞周期，抑制細胞凋亡。肺移植已成為各種終末期肺部疾病的重要治療手段，而缺血再灌注損傷是影響肺移植成功率的最大制約因素[2]。近年來，隨著micro-RNA及其下游調節(jié)機制影響腫瘤細胞增殖的研究不斷深入，其在缺血再灌注損傷中的作用也越來越受到關注，但在肺缺血再灌注過程中，microRNA及其下游調節(jié)蛋白的表達變化尚少有報道?；蛐酒夹g研究結果顯示，缺血肺組織中microRNA-451的表達量上調2倍以上[3]。本實驗應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot方法，檢測缺血再灌肺組織中microRNA-451及p-AKT蛋白的表達情況。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康清潔級雄性Wistar大鼠50只，體質量為250～300 g，均購自山東魯抗醫(yī)藥公司實驗動物中心；PrimeScript?RT reagent Kit及Premix Ex TaqTM，均購自大連寶生物工程有限公司；TaqMan?MicroRNA Assay Kit，購自Applied Biosystems公司；兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔單克隆抗體，均購自康維世紀公司；兔抗大鼠p-AKT多 克隆抗體，購自 Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

Wistar大鼠50只，隨機分為對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組，每組10只大鼠。麻醉大鼠，行氣管插管后接呼吸機，仰臥位固定大鼠，于胸骨左側第5肋間進胸，松解下肺韌帶，游離出肺門根部，手術中注意保護肺組織，避免組織損傷。予100 U肝素靜注，5 min后(肺中度膨脹時)，于肺門處用血管夾阻斷血流，手術后碘附水沖洗胸腔，無菌敷料覆蓋切口。對照組于松解下肺韌帶后取材，不作血流阻斷；缺血組于阻斷肺門1 h后取材；再灌注1、3、6 h組于阻斷肺門1 h后去除血管夾，恢復肺組織血供，分別于再灌注1、3、6 h后取材，取材前予生理鹽水沖洗肺組織。阻斷上、下腔靜脈血流處死動物。穿刺左心耳，經右心室行壓力灌洗(30 mL生理鹽水，2.94 kPa)，完整取出左全肺后，置液氮中-80 ℃保存。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1總RNA、總蛋白提取及測定 用TRIzol及microRNA提取專用試劑盒，提取標本肺組織的總RNA，紫外線分光光度計測定吸光度(A)值。蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑中研磨并超聲裂解肺組織，離心，加SDS后水浴，-20 ℃保存。

1.3.2microRNA-451蛋白表達檢測 采用RT-qPCR方法，通過microRNABase及相關文獻[4]獲取其引物序列。microRNA-451引物序列：5′-AAA-CCGUUACCAUUACUGAGUU-3′，應用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒TaqMan?探針分析法進行逆轉錄，逆轉錄產物cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑誔remix Ex Taq及TaqMan?MicroRNA Assay Kit試劑說明書進行PCR標準程序擴增，U6為內參(引物序列為5′-GTGCTCGCTTC-GGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATA-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAG-GATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-ATTT-3′)，檢測microRNA-451相對表達量。

1.3.3P-AKT蛋白表達檢測 采用Western blot方法，以GAPDH作為對照,行SDS-PAGE電泳。電泳完成后轉至硝酸纖維膜上，室溫下封閉2 h,TBST緩沖液洗3次,加入兔抗大鼠p-AKT多克隆抗體(1∶1 500)，4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育1 h；TBST及TBS各洗3次，ECL系統(tǒng)曝光顯影,凝膠分析系統(tǒng)分析p-AKT蛋白的表達。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗法，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 各組microRNA-451表達比較

對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組microRNA-451相對表達量分別為0.39±0.34、1.79±1.27、1.86±0.98、2.08±1.44、0.58±0.63。與對照組比較，缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組microRNA-451的相對表達量呈現(xiàn)先上調后下調的趨勢，其中再灌注3 h組microRNA-451的表達量最高，差異有顯著意義(F=17 244.32,P<0.05)。

2.2 各組p-AKT蛋白表達比較

對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組的p-AKT蛋白相對表達量分別為0.32±0.01、0.18±0.02、0.16±0.01、0.13±0.01、0.21±0.02。對照組AKT蛋白相對表達量最高，再灌注3 h組表達量最低，差異有顯著性(F=136.02,P<0.05)。

3 討 論

microRNA是一類內源性非編碼小RNA，具有高度保守的基因序列，在RNA聚合酶Ⅱ的催化下細胞核內轉錄出序列較長的pri-microRNA，經過Drosha酶及Dicer酶的修飾可形成成熟的micro-RNA，它可與序列基本互補的mRNA結合，通過阻止蛋白質翻譯過程或直接降解mRNA，實現(xiàn)基因表達的調控作用，從而影響細胞的增殖、分化、凋亡、新陳代謝等過程。NAN等[5]研究結果顯示，micro-RNA-451可抑制膠質瘤細胞生長、增殖，促進細胞的凋亡。WANG等[6]研究結果顯示，microR-451 可靶向調控RAB14，從而顯著抑制非小細胞肺癌生長。BRANDRES等[7]研究顯示，microRNA-451在胃及結直腸癌中呈低表達，且表達水平與預后呈正相關，將pre-microRNA-451轉染入結直腸癌細胞中, 腫瘤細胞生長受到抑制。TIAN等[8]研究顯示，人腦膠質瘤細胞中microRNA-451可通過CAB39抑制PI3K/AKT途徑，從而抑制腫瘤細胞生長。

AKT蛋白是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，它處于PI3K/Akt 信號轉導通路的核心部位，可通過PDK-1磷酸化Thr308、Ser473兩個位點后，實現(xiàn)完全激活，發(fā)揮生物學活性。近年來，對于p-AKT的研究不斷深入，大量研究證實，AKT蛋白具有促進細胞生長增殖，抑制細胞凋亡的作用[9]。已有研究結果顯示，p-AKT蛋白在非小細胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及結直腸癌等組織中均表達增高[10]。WIDMANN等[11]研究結果顯示，細胞凋亡時，AKT可出現(xiàn)水解現(xiàn)象，表達量降低。JETZT等[12]將AKT的磷酸化位點滅活，通過一種復制缺陷型腺病毒將失活的AKT轉入腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖受到抑制。

本研究應用RT-qPCR以及Western blot法，檢測microRNA-451及P-AKT蛋白在大鼠肺缺血再灌注組織中的表達情況，結果顯示兩者在表達上存在一定的相關性。結合相關文獻結果[8,13]，認為microRNA-451可能通過調節(jié)p-AKT蛋白的表達對細胞的增殖和凋亡發(fā)揮作用。本文的實驗結果顯示，隨著缺血再灌注時間的延長，microRNA-451的表達呈現(xiàn)先上調后下降的趨勢，而p-AKT蛋白的表達則是呈現(xiàn)先下降后上調的相反的結果，推斷microRNA-451促進細胞凋亡的作用可能是通過調節(jié)p-AKT蛋白通路實現(xiàn)的。這有可能為肺缺血再灌注損傷的預防及治療提供一條新的思路。但是，microRNA-451對p-AKT蛋白調節(jié)的具體機制尚需要進一步研究。microRNA-451是否存在其他靶點對缺血再灌注損傷進行調控及p-AKT蛋白調控細胞周期的具體機制目前尚未得到證實。

[參考文獻]

[1]AMBROS V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature, 2004,431(76):350-355.

[2]HOSENPUD J D, BENNETT L E, KECK B M, et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: sixteenth official report-1999[J]. Journal of Heart and Lung Transplantation, 1999,18(7):611-626.

[3]任鵬濤,沈毅,玄云鵬,等. 大鼠肺缺血急性期肺組織microRNA的表達變化[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2012,27(5):434-436.

[4]RIVAS M A V L, SCHILLACI R A. Downregulation of the tumor-suppressor miR-16 via progestin-mediated oncogenic signaling contributes to breast cancer development[J]. Breast Cancer Research, 2012,14(3): R77-R80.

[5]NAN Y, HAN L, ZHANG A, et al. MiRNA-451 plays a role as tumor suppressor in human glioma cells[J]. Brain Res, 2010,1359:14-21.

[6]WANG R, WANG Z X, YANG J S, et al. MicroRNA-451 functions as a tumor suppressor in human non-small cell lung cancer by targeting ras-related protein 14 (RAB14)[J]. Oncogene, 2011,30(23):2644-2658.

[7]BANDRES E, BITARTE N, ARIAS F, et al. microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J]. Clin Can-cer Res, 2009,15(7):2281-2290.

[8]TIAN Y, NAN Y, HAN L, et al. MicroRNA miR-451 downregulates the PI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma[J]. Int J Oncol, 2012,40(4):1105-1112.

[9]GHARIBI B, GHUMAN M S, HUGHES F J. Akt-and Erk-mediated regulation of proliferation and differentiation during PDGFR beta-induced MSC self-renewal[J]. J Cell Mol Med, 2012,16(11):2789-2801.

[10]SCHLIEMAN M G, FAHY B N, RAMSAMOOJ R, et al. Incidence, mechanism and prognostic value of activated AKT in pancreas cancer[J]. Br J Cancer, 2003,89(11):2110-2115.

[11]WIDMANN C, GIBSON S, JOHNSON G L. Caspase-depen-dent cleavage of signaling proteins during apoptosis. A turn-off mechanism for anti-apoptotic signals[J]. J Biol Chem, 1998,273(12):7141-7147.

[12]JETZT A, HOWE J A, HORN M T, et al. Adenoviral-me-diated expression of a kinase-dead mutant of Akt induces apoptosis selectively in tumor cells and suppresses tumor growth in mice[J]. Cancer Res, 2003,63(20):6697-6706.

[13]LI H Y, ZHANG Y, CAI J H, et al. MicroRNA-451 inhibits growth of human colorectal carcinoma cells via downregulation of Pi3k/Akt pathway[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(6):3631-3634.