易 鑫，李 娟，黃 京，程 正，劉新春

(1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049;2.珠海市水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，廣東珠海 519020)

為應(yīng)對(duì)日益突出的水資源短缺問(wèn)題，人們?cè)絹?lái)越多地將生活污水經(jīng)再生處理后用作綠化或景觀用水，用以改善城市的生態(tài)環(huán)境并節(jié)約寶貴的水資源，但再生水回用所引起的病原菌污染問(wèn)題也正時(shí)刻威脅著人類健康，尤其是一些高致病性的病原菌流入水環(huán)境，對(duì)人體健康和生態(tài)安全構(gòu)成了直接的威脅［1-3］。近年來(lái)，由于病原體對(duì)水體的污染，也時(shí)常引發(fā)水媒型傳染病的爆發(fā)［4，5］。據(jù)估計(jì)，單由水媒型傳染病所造成的死亡人數(shù)約占全世界總死亡人數(shù)的4%［6］。由此可見(jiàn)，控制致病菌向環(huán)境的排放有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

盡管目前污水處理工藝，能去除大部分的病原菌，大腸桿菌的去除可以達(dá)到2～3個(gè)數(shù)量級(jí)［7-9］，但出水中大腸桿菌濃度依然嚴(yán)重超標(biāo)。因而，需配以切實(shí)有效的致病菌防治措施，消除其危害。理論上講，加氯消毒方法可解決這一問(wèn)題，但操作起來(lái)難度較大。因加氯太少，達(dá)不到消毒效果;加氯過(guò)多，又將導(dǎo)致消毒成本奇高，且易產(chǎn)生三氯甲烷、鹵乙腈等二次污染物［10］。此外，加氯消毒的方法并不是對(duì)所有的病原體都有效，且加氯消毒后排入環(huán)境的再生水也仍然存在較大的健康風(fēng)險(xiǎn)。消毒措施之外的另一有效途徑就是利用噬菌體技術(shù)處理污水中的病原菌。

噬菌體是一類感染細(xì)菌、真菌、放線菌和螺旋體等微生物的病毒的總稱，具有特異性強(qiáng)、自我增殖快、來(lái)源極廣等其他一些抗菌劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)［11］。噬菌體療法也逐漸成為抗耐藥菌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)［12］。Withey等［13］認(rèn)為噬菌體處理技術(shù)有可能是一種長(zhǎng)期的、有效的病原菌處理方式。

1 噬菌體的基本特征

噬菌體(bacteriophage)具有高度嚴(yán)格的宿主特異性，往往一種噬菌體只侵染一種細(xì)菌或只侵染某一菌株，而不會(huì)對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞進(jìn)行侵染并且只寄居在易感染宿主菌體內(nèi)。它廣泛存在于自然界中，地球上大概有1032個(gè)噬菌體存在，是細(xì)菌數(shù)量的10多倍?？梢哉f(shuō)凡有細(xì)菌的地方，就會(huì)有噬菌體的蹤影［14］。2005年國(guó)際病毒分類委員會(huì)依據(jù)病毒核酸類型、形態(tài)結(jié)構(gòu)等特征對(duì)已經(jīng)確認(rèn)的噬菌體進(jìn)行了系統(tǒng)的分類與命名。除形態(tài)學(xué)分類外，根據(jù)與宿主菌作用模式的不同，通常可將噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體。其中一個(gè)烈性噬菌體感染一個(gè)細(xì)菌后，只需重復(fù)4個(gè)感染周期后，即可殺滅10億個(gè)細(xì)胞［15］。其殺死細(xì)菌的機(jī)制與抗生素不同，十分適合成為理想的“新作用模型”的新型抗菌劑。相比較而言，溫和噬菌體在病原菌防治上的實(shí)用價(jià)值并不高，因此，通常提到的治療細(xì)菌感染等的噬菌體均為烈性噬菌體。

2 噬菌體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及局限

(1)噬菌體技術(shù)相比于其他物理、化學(xué)藥劑等處理技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì):

1)噬菌體具有高度的特異性。只裂解相應(yīng)病原菌，不破壞其他正常菌群，從而避免引起如腹瀉、胃腸感染等副作用。另外有證據(jù)顯示即使是一部分存在免疫缺損的病人服用噬菌體治療細(xì)菌性感染也是很安全的［16］。

2)噬菌體可指數(shù)增殖［17］。在適當(dāng)?shù)臈l件下，每一個(gè)裂解周期內(nèi)，每一個(gè)噬菌體都可以產(chǎn)生200個(gè)子代噬菌體將以200n增殖。

3)細(xì)菌較難產(chǎn)生抗性。據(jù)報(bào)道［18］細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的突變頻率為10－7，而對(duì)抗生素的抗性突變頻率為10－6。另一方面，即使細(xì)菌產(chǎn)生一定的變異或抗性，噬菌體也能在一定條件下，迅速反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的變異以感染變異細(xì)菌。

4)無(wú)殘留。噬菌體高度依賴宿主菌，隨宿主菌的死亡而死亡，因此只在細(xì)菌感染部位發(fā)生作用，而不會(huì)引發(fā)其他感染，更不會(huì)殘留在體內(nèi)［19］。

5)噬菌體研制時(shí)間短，成本低。篩選新的噬菌體來(lái)裂解耐藥菌株的工作相對(duì)較快，有時(shí)僅通過(guò)一定的離心即可去除細(xì)菌碎片純化噬菌體，易保存、運(yùn)輸［19］。從進(jìn)化的觀點(diǎn)看，完全可利用自然選擇來(lái)篩選噬菌體治療耐藥或耐噬菌體的細(xì)菌。

(2)盡管噬菌體技術(shù)擁有諸多的優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限:

1)對(duì)宿主的高度特異性，使噬菌體的抗菌范圍縮小。另外，環(huán)境中只有20%的細(xì)菌是可培養(yǎng)的，對(duì)相應(yīng)噬菌體的培養(yǎng)分離產(chǎn)生了限制;

2)大部分細(xì)菌會(huì)對(duì)與共存噬菌體相同的噬菌體引起的感染產(chǎn)生抗性;

3)噬菌體穩(wěn)定性差，易受環(huán)境脅迫、太陽(yáng)輻射以及饑餓等因素影響，致使噬菌體數(shù)目減少;

4)缺乏鑒定噬菌體類別的標(biāo)準(zhǔn)，研究者因缺乏對(duì)噬菌體作用方式的了解，而無(wú)法區(qū)分溫和噬菌體和烈性噬菌體，誤將溫和噬菌體用于治療可能因溫和噬菌體的感染形成基因的水平轉(zhuǎn)移而致使非致病菌轉(zhuǎn)化為致病菌［13］。

3 噬菌體在污水處理系統(tǒng)中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀

相比于噬菌體應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)以及食品等領(lǐng)域中病原性感染而言，噬菌體用于污水處理中的研究仍處于試驗(yàn)階段。污水處理研究主要側(cè)重于噬菌體作為細(xì)菌檢測(cè)指示物以及在生活污水、活性污泥中提取并培育純化噬菌體，并且基本停留在對(duì)其種類鑒定和基本生物特性研究上。而在防治水中高發(fā)性致病菌方面的研究幾乎為空白。結(jié)合當(dāng)前對(duì)噬菌體用于其他領(lǐng)域病原菌防治技術(shù)的應(yīng)用，尤其是借鑒一些較為成熟、安全可靠的噬菌體防治技術(shù)，通過(guò)選擇典型的污水處理工藝進(jìn)一步調(diào)查研究主要高致病菌在水處理工藝過(guò)程中的分布與歸趨，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，再結(jié)合高致病菌歸趨途徑針對(duì)的投加單一或多種混合制劑的噬菌體，由小試試驗(yàn)來(lái)確定噬菌體對(duì)相關(guān)高致病菌的去除效果并累積相應(yīng)的技術(shù)參數(shù)，為逐步發(fā)展推廣并廣泛用于水媒型致病菌的防治，尤其對(duì)污水處理系統(tǒng)中存在的復(fù)雜多樣的高致病菌的防治。

3.1 噬菌體監(jiān)測(cè)病原菌

相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，用噬菌體檢測(cè)病原菌的操作具有特異性強(qiáng)、快捷、安全和設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。美國(guó)EPA［20］和澳大利亞昆士蘭政府［21］均已提出用大腸桿菌噬菌體作為病毒指示生物。Edgar等［22］利用量子點(diǎn)的方法與工程噬菌體相結(jié)合從而特異識(shí)別目標(biāo)細(xì)菌或從臨床及環(huán)境中分離細(xì)胞。其中，噬菌體作為模式病毒，已被用于評(píng)價(jià)水和污水的處理效率、闡明病毒滅活機(jī)理及改進(jìn)病毒檢測(cè)方法等領(lǐng)域的研究［23-25］。另外，利用噬菌體分型的技術(shù)也可方便區(qū)分細(xì)菌隔離群，并在流行病學(xué)研究中得到應(yīng)用。腸出血性大腸桿菌(EHEC)～I(xiàn)彎曲桿菌的研究［26］表明噬菌體的分型是非常有用的。近期有研究［27］發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌噬菌體可用于檢測(cè)娛樂(lè)用水以及污水等水體中大腸桿菌數(shù)量，以此可作為評(píng)價(jià)水體糞便污染的指示物。李潔等［28］以在洱海下游水體中分離出腸道致病菌噬菌體，作為判斷該水體遭受腸道致病菌的污染的指示標(biāo)志。Jebri等［3］通過(guò)調(diào)查研究突尼斯3個(gè)不同污水處理廠污水及活性污泥中噬菌體數(shù)量并以此作為除細(xì)菌指標(biāo)之外評(píng)價(jià)水體是否受腸道菌及腸道病毒污染的又一重要指標(biāo)。

3.2 噬菌體去除病原菌

由于在污水處理系統(tǒng)中，某種或多種病原菌的去除或數(shù)量下降，可能涉及較為復(fù)雜的水處理工藝環(huán)節(jié)及其他環(huán)境因素。從整體研究來(lái)看，更多的研究?jī)A向于將噬菌體只作為簡(jiǎn)單的病菌指示物對(duì)待，而忽視或未能深入研究噬菌體是否對(duì)去除病原菌起關(guān)鍵作用，因此有關(guān)噬菌體在污水處理過(guò)程中的作用知之甚少。Synnott等［29］通過(guò)將從污水中篩選分離出的3株寬譜噬菌體，制成混合制劑并成功用于裂解體外培養(yǎng)的E.coli O157:H7菌株;另外該研究組還從污水中分離出2株噬菌體可有效裂解金黃色葡萄球菌，對(duì)于牛乳腺炎的防治具有積極的意義。趙晨等［30］也從污水中分離純化出一株高裂解活性的金黃色葡萄球菌噬菌體 SIIA-SAP009。Lin等［31］分離出10株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB)噬菌體，能裂解多株鮑曼不動(dòng)桿菌，其中一株幾乎可以徹底去除一種多重耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌，這可能會(huì)是防治多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的另一良方。Wu等［32］從污水中分離出的肺炎克雷伯桿菌噬菌體Kpp95，能快速裂解宿主菌，除了能裂解許多產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯桿菌，還能裂解產(chǎn)酸克雷伯桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌。Turki等［33］對(duì)從廢水中分離到的沙門氏菌噬菌體的感染進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該噬菌體可減少沙門氏菌和腸桿菌科的其他菌群，而不損害其他功能菌群。Heringa等［34］將從污水中分離的多株噬菌體混合可有效減少沙門氏菌數(shù)量。不少研究者著手噬菌體去除污水處理系統(tǒng)中的銅綠單胞桿菌的研究。其中Vieira等［35］從污水處理廠污水樣品中篩選出一株噬菌體可有效抑制綠膿桿菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)表明在感染復(fù)數(shù)(MOI)為10時(shí)，可最大程度的控制綠膿桿菌生長(zhǎng)，同時(shí)并未發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌對(duì)此株噬菌體產(chǎn)生抗性。Zhang等［36］試驗(yàn)表明噬菌體可通過(guò)其特異性選擇性去除污水過(guò)濾系統(tǒng)中的宿主菌(銅綠假單胞菌)，在流量為1.6 mL/min，投加1 mL 濃度為5.1 ×106pfu(plaque forming units)/mL的噬菌體情況下，可有效去除無(wú)煙煤和活性炭過(guò)濾系統(tǒng)中的細(xì)菌，且在后續(xù)出水中無(wú)檢出，并不會(huì)對(duì)氨氧化反應(yīng)或氨氧化菌等菌群造成任何不良影響。Chaudhry等［37］從污水中分離出的一株噬菌體可有效裂解弗氏檸檬酸桿菌。

寬譜的噬菌體或噬菌體混合制劑可減少甚至消除某些細(xì)菌微生物，從而對(duì)微生物群落動(dòng)態(tài)具有控制性的影響。Wei等［38］通過(guò)對(duì)霍亂弧菌和其特異性噬菌體連續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)以及建立數(shù)學(xué)模型，研究表明噬菌體可通過(guò)對(duì)霍亂弧菌的捕食作用來(lái)限制菌群數(shù)量，影響菌落的發(fā)展。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，單一的噬菌體并不能長(zhǎng)久保持將細(xì)菌數(shù)量限制在較低水平，而兩種噬菌體混合使用可降低菌落數(shù)量?jī)蓚€(gè)數(shù)量級(jí)。Satoh等［39］利用16S rRNA研究實(shí)驗(yàn)室活性污泥系統(tǒng)中細(xì)菌數(shù)量變化時(shí)發(fā)現(xiàn)其中一細(xì)菌分類單位可能被存在的特異性噬菌體消除。有研究者［40］通過(guò)連續(xù)流并以單獨(dú)加氯(NaClO)、噬菌體以及二者結(jié)合的3種加藥方式均可有效去除污水處理中銅綠假單胞菌膜，其中噬菌體與氯聯(lián)合使用時(shí)效果((97±1)%)最好，而單獨(dú)投加噬菌體和加氯的去除率分別為(89±1)%和(40±5)%;通過(guò)降低噬菌體使用量的同時(shí)縮短連續(xù)加氯時(shí)間，在36 h內(nèi)即可去除(96±1)%的菌膜，這也為如何使用噬菌體用量和加氯時(shí)間的不斷優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)，為今后細(xì)菌膜的控制與去除提供了技術(shù)支持。Shapiro等［41］通過(guò)對(duì)處理高濃度工業(yè)廢水的生物膜反應(yīng)器長(zhǎng)達(dá)462 d的連續(xù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)噬菌體可通過(guò)對(duì)一種或多種宿主細(xì)菌的捕食決定污水處理系統(tǒng)中菌落的結(jié)構(gòu)組成變化。Otawa等［42，43］對(duì)多種不同污泥水處理系統(tǒng)中的研究證實(shí)噬菌體可能決定菌落的結(jié)構(gòu)與功能。

也有研究通過(guò)改變噬菌體給藥的方式來(lái)增強(qiáng)噬菌體的穩(wěn)定性，從而保持更持久的活性。Zhang等［44］研究表明噬菌體雞尾酒制劑有可能具有更廣泛的宿主范圍，并且通過(guò)將污水中沙門氏菌的多種噬菌體通過(guò)低成本的噬菌體微膠囊化過(guò)程可以使噬菌體穩(wěn)定性時(shí)間更長(zhǎng)，更能發(fā)揮持久的防治效果。Stanford等［45］研究表明通過(guò)將噬菌體微膠囊化后在強(qiáng)酸性條件下仍可保持良好的活性。此外，也有研究表明噬菌體并不能完全消滅宿主菌，而是在互相競(jìng)爭(zhēng)中達(dá)到共存的平衡狀態(tài)。Kashiwagi等［46］研究發(fā)現(xiàn)噬菌體感染宿主菌大腸桿菌過(guò)程中，二者均會(huì)發(fā)生一定的突變以適應(yīng)生存，大腸桿菌每復(fù)制一次的可突變約5.4×10－10bp，遠(yuǎn)低于噬菌體的1.5×10－3～10－5bp，但大腸桿菌也并不會(huì)因此而全部消亡，而是在這種不斷的競(jìng)爭(zhēng)中保持一定數(shù)量，二者因此共存。

3.3 噬菌體在污水處理中其他作用

在污水處理系統(tǒng)中，噬菌體除了有以上作用之外，噬菌體技術(shù)仍有多方面應(yīng)用價(jià)值，如提高污泥脫水性能、消化能力以及控制絲狀菌等［13］。Mandilara等［47］證明了污水中指示細(xì)菌及其噬菌體的相關(guān)性，并考慮到噬菌體相比于細(xì)菌指標(biāo)在多個(gè)污水處理環(huán)節(jié)存在更高的抗性，可較為穩(wěn)定地存在水體中且檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，并能潛在反映糞便污染，因此將其作為評(píng)估污水處理效果的工具。目前，已有研究將噬菌體應(yīng)用于解決污水處理系統(tǒng)中的污泥膨脹問(wèn)題。Kotay等［48，49］分別從污水處理系統(tǒng)中分離了針對(duì)絲狀細(xì)菌Sphaerotilus natans的噬菌體，并證明了相應(yīng)噬菌體可通過(guò)控制絲狀菌的生長(zhǎng)數(shù)量，從而降低曝氣池SVI值，對(duì)防止污泥膨脹具有重要作用。

4 展望

就噬菌體在致病菌防治研究應(yīng)用的發(fā)展進(jìn)程來(lái)看，由于其強(qiáng)大的殺菌能力，作為治療制劑使用的前景十分光明［50，51］;噬菌體在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及食品行業(yè)中治療細(xì)菌感染尤其是耐藥菌感染的防治效果得到大量動(dòng)物等臨床試驗(yàn)的充分肯定。但噬菌體正式用于動(dòng)物或人類細(xì)菌性感染疾病的臨床治療，仍面臨諸多嚴(yán)峻問(wèn)題。有研究［52］顯示目前世界范圍內(nèi)水媒型傳染病的高發(fā)主要原因是由污水處理廠的污水排放引起此疾病傳播。通過(guò)對(duì)當(dāng)前使用最廣最典型的污水處理工藝中一些高致病菌(比如大腸桿菌O157、沙門氏菌、軍團(tuán)菌和綠膿桿菌等突出的致病性強(qiáng)又易于傳播的病菌)開(kāi)展調(diào)查研究，進(jìn)一步揭示此類病原菌不同季節(jié)在各個(gè)污水處理工藝的不同階段的數(shù)量變化及歸趨，做好實(shí)時(shí)的設(shè)點(diǎn)監(jiān)測(cè)，從而為今后針對(duì)性超前性地投加相應(yīng)的噬菌體制劑，進(jìn)而防止致病菌的傳播爆發(fā)發(fā)揮作用。通過(guò)研究并利用相應(yīng)的生物工程改造，使其只侵染特定種類的病原菌，而對(duì)其他種類細(xì)菌的影響很小甚至沒(méi)有，在去除病原菌的同時(shí)并不影響環(huán)境的安全。因此，應(yīng)不斷加強(qiáng)對(duì)于噬菌體防治病原菌技術(shù)的研究，并通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)逐漸將其用于污水處理系統(tǒng)中病原菌的去除。

綜上所述，噬菌體去除污水中病原菌技術(shù)，具有低成本、特異性較強(qiáng)及高效性的突出特點(diǎn)，在未來(lái)污水處理領(lǐng)域中的應(yīng)用具有廣闊的空間和良好的前景。

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