周 通，徐 波

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌330045)

1 亞硝酸鹽污染是發(fā)酵食品生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題

我國蔬菜深加工產(chǎn)品-醬腌菜生產(chǎn)歷史悠久，品種繁多。食用醬腌菜，可攝入益生菌-乳酸菌及其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸等，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，防止便秘，刺激腸道免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抑制腸道腐敗細(xì)菌生長，減弱腐敗菌在腸道產(chǎn)毒，防止細(xì)胞老化，降低膽固醇，調(diào)節(jié)人體生理功能等保健和醫(yī)療作用。

但是蔬菜在腌制和貯藏過程中極易產(chǎn)生亞硝酸鹽污染。由于亞硝酸鹽可與食品中蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物次級(jí)胺(仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸)結(jié)合，生成強(qiáng)致癌的N-亞硝基化合物，長期攝入亞硝酸鹽有致突變和致癌的危險(xiǎn)，可誘發(fā)肝癌、食管癌、胃癌等多種癌癥和疾病。隨著人們食品安全意識(shí)的提高，發(fā)酵食品中亞硝酸鹽污染的安全問題也日益受到人們的關(guān)注，如何降解亞硝酸鹽類物質(zhì)是發(fā)酵食品生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題［1］。

2 利用食品級(jí)亞硝酸鹽還原酶降解發(fā)酵食品中產(chǎn)生的亞硝酸鹽，是應(yīng)對(duì)亞硝酸鹽污染的根本對(duì)策，對(duì)保障我國食品安全具有重要意義

目前，國內(nèi)外對(duì)蔬菜加工中亞硝酸鹽的研究主要集中在蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽變化規(guī)律，而對(duì)亞硝酸鹽的降解機(jī)理研究，以及影響亞硝酸鹽的微生物菌系及其相關(guān)酶系等則研究甚少。利用微生物降解亞硝酸鹽是當(dāng)前的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。微生物降解亞硝酸鹽主要是利用亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，Nir)降低亞硝酸鹽含量［2］，尤其是利用食品級(jí)安全菌株-乳酸菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶徹底降解亞硝酸鹽是應(yīng)對(duì)亞硝酸鹽污染的根本對(duì)策，對(duì)保障我國食品安全具有重要意義［3］。

3 乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分子調(diào)控機(jī)制尚不明晰

從生物脫氮理論分析亞硝酸鹽降解有羥胺途徑還原成氨氣和還原成氮?dú)?個(gè)途徑。一些兼性厭氧細(xì)菌能利用硝酸氮為營養(yǎng)，在硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的作用下將硝酸鹽還原為氨，進(jìn)而生物合成氨基酸、蛋白質(zhì)和其它含氮有機(jī)物。

迄今為止，人們共發(fā)現(xiàn)了4種類型Nir，其中nirK編碼的可溶性含銅酶和nirS編碼的細(xì)胞色素cd1還原酶被廣泛研究。這2種酶在限氧和厭氧條件下以N代替O2作為電子受體構(gòu)成氧化呼吸鏈，使N接受電子被還原為NO，它們雖然在結(jié)構(gòu)上有差異，但功能和生理上無差異［4，5］。nrfA編碼的細(xì)胞色素C亞硝酸鹽還原酶和nasB編碼的亞硝酸鹽同化還原酶催化N還原為N，其主要差別是前者將N排放到細(xì)胞外，后者利用N合成氨基酸［6］。

NirS分子量約為120KDa，由2個(gè)相同的亞單位組成，每單位含一個(gè)e型和d1型血紅素，脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)Nir晶體結(jié)構(gòu)的研究表明:c亞鐵血紅素是電子進(jìn)入位點(diǎn)，而d1是底物結(jié)合和催化的活性中心［7］。NirK為三聚體，每個(gè)亞單位有2個(gè)銅原子，分子量為36KDa，2個(gè)銅原子組成Ⅰ型(藍(lán)色)銅活性中心和Ⅱ型(非藍(lán)色)銅活性中心。Ⅰ型與亞單位內(nèi)的基團(tuán)結(jié)合，Ⅱ型與三聚體中2個(gè)亞單位的基團(tuán)結(jié)合，Ⅰ型被認(rèn)為是電子由供體流向Nir的入口，Ⅱ型則被認(rèn)為是催化中心，亞硝酸鹽結(jié)合在Ⅱ型上［8］。

在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pa.denitrificans和斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)中，nir和一氧化氮還原酶(Nor)的結(jié)構(gòu)基因(nor)在染色體上相距10 kb，是一對(duì)連鎖基因［9，10］，并且nir與相關(guān)基因也常常發(fā)生連鎖。在P.aeruginosa中，11個(gè)nir相鄰基因表達(dá)產(chǎn)物都與Nir活性有關(guān)［11］，有些基因以同一方向轉(zhuǎn)錄至一條mRNA中［12］。然而，在P.stutzeri細(xì)胞內(nèi)，有些基因被重新排列，相關(guān)基因不再相鄰，且轉(zhuǎn)錄至3條或3條以上mRNA中［13］。

目前對(duì)Nir的生化和分子機(jī)理研究主要集中在反硝化固氮菌如P.stutzeri和Pa.denitrificans的研究，而對(duì)乳酸菌的nir操縱子(nir operon)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制的研究鮮有報(bào)道，其分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

4 研究乳酸菌氮代謝全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白GlnR對(duì)Nir的調(diào)控機(jī)制，不僅是揭示亞硝酸鹽降解的分子調(diào)控機(jī)制的首要研究內(nèi)容，也是加快消除發(fā)酵食品、飼料中亞硝酸殘留等問題的必要基礎(chǔ)

革蘭氏陽性細(xì)菌已進(jìn)化出復(fù)雜、多樣的氮代謝調(diào)控機(jī)制，而氮代謝全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白GlnR廣泛存在于革蘭氏陽性細(xì)菌中，對(duì)很多參與氮代謝的基因都有調(diào)控作用。氮代謝途徑的相關(guān)基因中，glnA、gdhA、glnPQ、amtB、nirBD、ureA、glnK、glnD等均受GlnR的調(diào)控［12，14］。目前發(fā)現(xiàn)的GlnR既有MerR家族也有OmpR家族，針對(duì)可利用氮源的變化，GlnR可以抑制或激活氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)。因此，研究GlnR介導(dǎo)的代謝調(diào)控有助于深入了解細(xì)菌中心氮代謝，對(duì)研究氮代謝調(diào)控中的信號(hào)傳導(dǎo)等具有重要的意義。

最近，通過生物信息學(xué)手段搜尋與GlnR結(jié)合序列的啟動(dòng)子，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，在天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中發(fā)現(xiàn)10個(gè)GlnR靶標(biāo)，這些基因主要有負(fù)責(zé)氮的吸收和調(diào)節(jié)的操縱子(amtB-glnK-glnD)，亞硝酸鹽和硝酸鹽的降解基因(nirB和nasA)，脲酶基因(ureA)以及谷氨酸和谷氨酰胺合成基因(glnA，glnII和gdhA)，GlnR主要對(duì)其靶基因起激活或抑制作用。在氮源限制時(shí)，GlnR可以激活glnA，glnII，amtB和nirB的表達(dá)，并抑制gdhA(編碼GDH)和ureA(編碼尿酶)的轉(zhuǎn)錄［15，16］。Rafat等人發(fā)現(xiàn)S.coelicolor的一個(gè)GlnR新的靶基因-nnaR(硝酸鹽和亞硝酸鹽降解調(diào)控子)編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，其N端為推定的類-HemD酶區(qū)域，C端為DNA結(jié)合域，NnaR不是酶激活蛋白但作為GlnR共激活因子調(diào)控硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶基因的轉(zhuǎn)錄［17］。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為最典型的低G+C含量革蘭氏陽性菌模式菌株，其氮代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已有詳盡的報(bào)道［18］。2個(gè)MerR家族的調(diào)控蛋白GlnR和TnrA，以及全局調(diào)控蛋白CodY相互協(xié)調(diào)控制氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)，以保證枯草芽孢桿菌在不同氮源條件下獲得充足的氮源。GlnR和TnrA通過感應(yīng)谷氨酰胺的濃度來實(shí)施調(diào)控，它們識(shí)別相同的操作子序列(TnrA/ GlnR識(shí)別位點(diǎn)，5-T6TNA-7NTNACAT-3)。GlnR可以抑制其所在操縱子glnRA以及脲酶操縱子ureABC，甚至tnrA基因的表達(dá)，而TnrA可以激活或抑制氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)。TnrA只有在氮源受限時(shí)被激活，而 GlnR在氮源過量時(shí)被激活［19～21］。通過BLASTP程序比對(duì)NCBI的乳酸桿菌基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的乳酸桿菌中均無TnrA的同源物，只有GlnR調(diào)控蛋白，并且乳酸桿菌存在多種氨基酸營養(yǎng)缺陷型。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis MG1363)是乳酸菌的模式菌株，Rasmus Larsen［22］等通過構(gòu)建乳酸乳球菌glnR缺失突變株結(jié)合DNA微陣列方法發(fā)現(xiàn)了10個(gè)GlnR靶標(biāo)，其中包括直接靶標(biāo)gln-RA操縱子(銨轉(zhuǎn)運(yùn)及感應(yīng)操縱子amtB-glnK和谷氨酰胺/谷氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因glnPQ)。乳酸乳球菌glnR缺失突變株中g(shù)lnA、amtB-glnK操縱子的表達(dá)被高度抑制，amtB-glnK啟動(dòng)子-35區(qū)上游的GlnR盒對(duì)GlnR介導(dǎo)的抑制作用極為重要。

GlnR不僅參與細(xì)菌的氮代謝調(diào)控，同時(shí)也與細(xì)菌的多種代謝途徑存在交叉調(diào)控。隨著研究不斷深入，越來越多氮代謝相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)受GlnR的調(diào)控，GlnR的調(diào)控作用甚至與細(xì)菌毒性、次級(jí)代謝、磷酸鹽同化等方面均有關(guān)［23］。但是GlnR對(duì)這些靶標(biāo)基因的間接調(diào)控作用有待于進(jìn)一步的研究。深入研究GlnR在其它代謝途徑中的作用，對(duì)進(jìn)一步闡述GlnR參與次級(jí)代謝活性產(chǎn)物、細(xì)菌形態(tài)分化、細(xì)菌毒性等的調(diào)控具有重要的意義。

5 研究乳酸菌亞硝酸還原酶代謝調(diào)控意義

隨著更多細(xì)菌基因組測(cè)序的完成，結(jié)合強(qiáng)有力的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段，以及高通量技術(shù)的應(yīng)用，如蛋白質(zhì)組技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等，為理清全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的復(fù)雜關(guān)系提供了有效手段，越來越多的GlnR靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)，其中不乏間接靶標(biāo)，但是GlnR對(duì)這些靶標(biāo)基因的間接調(diào)控作用有待于進(jìn)一步的研究。雖然幾個(gè)菌屬中GlnR的調(diào)控模式已經(jīng)研究得很詳細(xì)，但調(diào)控GlnR活性的信號(hào)和機(jī)制目前還不是很清楚，亟須更深入的研究?？梢姡瑯?gòu)建乳酸菌氮代謝的基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)、明確基因轉(zhuǎn)錄的相互調(diào)控關(guān)系和關(guān)鍵調(diào)控基因已具備了必須的技術(shù)條件;基因轉(zhuǎn)錄的相互調(diào)控關(guān)系和關(guān)鍵調(diào)控基因的明確不僅是揭示亞硝酸鹽降解的分子調(diào)控機(jī)制的首要研究內(nèi)容，也是加快消除發(fā)酵食品、飼料中亞硝酸殘留等問題必要基礎(chǔ)。

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