呂 楓，趙興秀*，李仕魯，劉苑皓，何義國(guó)，方春玉，鄒 偉，趙長(zhǎng)青，艾小滿

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

酵母菌是白酒發(fā)酵工業(yè)中的核心微生物，與白酒的品質(zhì)息息相關(guān)[1]。一般酵母菌的乙醇發(fā)酵溫度為28～33 ℃[2]，這一條件限制了酵母在較高溫度下進(jìn)行正常的生產(chǎn)作業(yè)[3]，也大大提高了乙醇生產(chǎn)的成本。白酒的獨(dú)特風(fēng)味主要是產(chǎn)香酵母產(chǎn)生的酯類、酸、醇等微量物質(zhì)[4]，這些微量物質(zhì)決定了白酒的風(fēng)格與品質(zhì)[5]，如醬香型白酒主要是靠乙酸乙酯和乳酸乙酯形成的主體香[6]。使用耐高溫產(chǎn)香酵母不僅能縮短生產(chǎn)周期，提高發(fā)酵產(chǎn)率[7]，有利于降低生產(chǎn)水耗、電耗[8]，保證在夏季高溫下正常生產(chǎn)[9-10]，而且有利于白酒的香味物質(zhì)形成及品質(zhì)的提高[11-12]。

目前，對(duì)白酒生產(chǎn)中既耐高溫又產(chǎn)香能力強(qiáng)的酵母的研究報(bào)道還比較少，如王珍等[13]從鳳型大曲中篩選出耐高溫高產(chǎn)乙醇酵母，但缺乏對(duì)其產(chǎn)香能力進(jìn)行研究；根據(jù)張俊杰等[14]研究報(bào)道，篩選出了一株產(chǎn)香性能較好的酵母菌，但其最佳發(fā)酵溫度是28 ℃，不利于夏季的生產(chǎn)。因此研究白酒生產(chǎn)中的耐高溫產(chǎn)香酵母十分必要。

本研究從醬香型白酒窖醅中篩選一株耐高溫產(chǎn)香酵母，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其乙醇耐受性和產(chǎn)乙醇能力進(jìn)行研究，同時(shí)運(yùn)用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀測(cè)定該菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性香氣成分，為其在白酒的后期研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香型白酒窖醅：四川郎酒股份有限公司；某品牌酵母：市售。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、瓊脂（均為分析純）：成都科隆化學(xué)品有限公司；酵母膏、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；小麥、高粱：市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 L，自然pH值。固體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：葡萄糖200 g，尿素5 g，CaCl20.55g，蛋白胨10g，KH2PO41g，酵母膏6g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

固態(tài)產(chǎn)香培養(yǎng)基[15]：高粱整粒與碎粒質(zhì)量比為3∶1，小麥全粉碎，高粱與小麥質(zhì)量比為1∶1，混勻，100 g固體培養(yǎng)基中加入60 mL 95 ℃的熱水，潤(rùn)糧5 h，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，加入200 U/g淀粉的糖化酶，在60 ℃條件下保溫2 h，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)：蘇州金凈凈化設(shè)備有限公司；BSC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任工司；XB-K-25血球板計(jì)數(shù)器：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 耐高溫產(chǎn)香酵母菌的篩選

（1）耐高溫產(chǎn)香溫酵母菌的初篩：取15 g醬香型白酒窖醅于135 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)2 d。富集后用10倍系列梯度稀釋法稀釋至10-5，取稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5的菌懸液0.2 mL分別涂布于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2 d。采用接種環(huán)挑取菌落形態(tài)不同的單菌落分別于YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線，純化2～3次。純化完成后將菌種接種于YPD斜面培養(yǎng)基中于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，隨后保存于4 ℃冰箱中備用。

（2）耐高溫產(chǎn)香酵母菌的復(fù)篩：采用平板劃線法將純化的酵母菌株接種于YPD平板上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌的生長(zhǎng)狀況，平行3次。將酵母菌依次放置在溫度分別為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察酵母菌的生長(zhǎng)狀況，篩選出能耐高溫且產(chǎn)生香味的菌株。

（3）耐乙醇酵母的選擇：利用無(wú)菌生理鹽水將耐高溫酵母制備成1×105CFU/mL菌懸液，按5%（V/V）的接種量接入含體積分?jǐn)?shù)6%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中，40 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d。用不接種的無(wú)菌YPD培養(yǎng)液為對(duì)照組，測(cè)定各菌懸液的吸光度值（OD600nm值），篩選出耐乙醇能力強(qiáng)的菌株作進(jìn)一步研究。

1.3.2 耐高溫產(chǎn)香酵母菌的鑒定

（1）形態(tài)觀察：將篩選出的酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d，對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察及描述，并在顯微鏡下對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

（2）生理生化試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[16]對(duì)篩選出的酵母菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、維生素缺失試驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)。

（3）分子生物學(xué)鑒定：參照文獻(xiàn)[17-18]提取篩選出的耐高溫產(chǎn)香酵母菌的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用正向引物NL-1和反向NL-4引物PCR擴(kuò)增26S rDNA序列，送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA基因序列，通過(guò)Clustalx1.83軟件進(jìn)行序列多重比較，使用Mega6.0軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.3 耐高溫產(chǎn)香酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將篩選出的耐高溫產(chǎn)香酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用血小板計(jì)數(shù)器對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定其菌體濃度為2.5×107CFU/mL，制成種子液備用。將種子液按5%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，裝液量250 mL/500 mL，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d。每隔2 h在無(wú)菌環(huán)境下取樣，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。以培養(yǎng)時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 不同溫度下耐高溫產(chǎn)香酵母的耐乙醇能力

1.3.5 耐高溫產(chǎn)香酵母產(chǎn)乙醇能力分析

將耐高溫產(chǎn)香酵母種子液按5%（V/V）的接種量接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量150 mL/500 mL，先在30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)6 h，然后于40 ℃條件下靜置發(fā)酵5 d，每24 h以無(wú)菌操作技術(shù)將瓶?jī)?nèi)的CO2排去。以某品牌酵母作為參比對(duì)象來(lái)評(píng)價(jià)該耐高溫產(chǎn)香酵母菌的產(chǎn)乙醇能力[20]。取發(fā)酵液100 mL于蒸餾瓶中，接入冷凝裝置，收集100 mL餾出液，蒸餾過(guò)程控制在30 min左右，用酒精計(jì)測(cè)定餾出液酒精度，用溫度計(jì)測(cè)定此時(shí)的溶液溫度，記錄數(shù)據(jù)，并換算為溫度20 ℃時(shí)的酒精度[21]。參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》，利用直接滴定法測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇縖22]。

1.3.6 耐高溫產(chǎn)香酵母固態(tài)產(chǎn)香試驗(yàn)

按5%（V/V）的接種量將耐高溫產(chǎn)香酵母種子液接種于固態(tài)產(chǎn)香培養(yǎng)基中，28 ℃條件下厭氧發(fā)酵5 d，采用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。

（1）頂空固相微萃?。喝? g固體發(fā)酵產(chǎn)物于15 mL萃取瓶中，將50/30 μm DVB/CAR-PDMS萃取針插入萃取瓶中，先60 ℃條件下平衡15 min，后60 ℃萃取40 min。萃取后將萃取針打入氣質(zhì)聯(lián)用儀，230 ℃解吸5 min[23]。

（2）色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min；HP-5MS 5%Pheny Methyl Siloxance色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：柱溫50 ℃，保留2 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min。

（3）質(zhì)譜條件：離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，離子溫度230 ℃，電離能量70 eV，倍增器電壓380 V，接口溫度280 ℃，發(fā)射電流34.6 mA，掃描范圍10～550 u。

（4）定性定量分析方法

3) 會(huì)展英語(yǔ)教學(xué)手段和方法缺乏創(chuàng)新。目前，專業(yè)英語(yǔ)教學(xué)還是一支鉛筆、一本書加上老師一張嘴的模式，多媒體資源還沒(méi)有得到充分的利用。

定性：通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索香味化合物，與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（nationalinstitute ofstandardsandtechnology，NIST）中譜庫(kù)的質(zhì)譜信息相匹配。

定量：按照峰面積歸一化法定量分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)操作重復(fù)3次，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫產(chǎn)香酵母菌的篩選

從YPD培養(yǎng)基上挑取菌落濕潤(rùn)、光滑、粘稠、乳白色且具有芳香味的單菌落27株，編號(hào)為Y1～Y27，經(jīng)純化后接種于YPD培養(yǎng)基上，分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在45 ℃條件下能夠生長(zhǎng)的菌株只有Y2、Y12、Y27，而在50 ℃條件下所有菌株均無(wú)法正常生長(zhǎng)。

2.2 耐高溫產(chǎn)香酵母耐乙醇能力的測(cè)定

菌株Y2、Y12、Y27對(duì)體積分?jǐn)?shù)6%乙醇的耐受性見(jiàn)圖1。

由圖1可知，菌株Y12在含體積分?jǐn)?shù)6%乙醇的YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況最好，OD600nm值最高，為0.936，其次為菌株Y2號(hào)（OD600nm值為0.830），菌株Y27最低（OD600nm值為0.735）。因此，選用菌株Y12為試驗(yàn)菌株。

圖1 3株酵母的耐乙醇能力Fig.1 Ethanol tolerance of 3 strains of yeast

2.3 菌株Y12的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

菌株Y12的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株Y12的菌落表面濕潤(rùn)，凸起，四周平整，直徑較?。患?xì)胞形態(tài)多為橢圓形，直徑為1 nm。

圖2 菌株Y12的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain Y12

2.3.2 生理生化試驗(yàn)

菌株Y12生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株Y12的糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[24]，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，初步鑒定菌株Y12為畢赤氏酵母屬（Pichia）。

表1 菌株Y12的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strain Y12

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株Y12的系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖3。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株Y12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Y12 based on 26S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株Y12與庫(kù)得畢赤酵母（Pichia kudriavevii）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合其形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)，鑒定菌株Y12為庫(kù)得畢赤酵母（Pichia kudriavevii）。

2.4 菌株Y12生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌株Y12的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株Y12培養(yǎng)0～2 h為遲滯期，培養(yǎng)2～6 h為對(duì)數(shù)期，6 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。

圖4 菌株Y12的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain Y12

2.5 不同溫度下耐高溫產(chǎn)香酵母Y12的耐乙醇能力

不同溫度下耐高溫產(chǎn)香酵母Y12的耐乙醇能力見(jiàn)圖5。

圖5 不同溫度下菌株Y12的乙醇耐受性Fig.5 Ethanol tolerance of strain Y12 at different temperature

由圖5可知，菌株Y12在35 ℃條件下，在含體積分?jǐn)?shù)4%、6%乙醇的YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好，在含體積分?jǐn)?shù)8%乙醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)被抑制，OD600nm值下降了50%，在含體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的培養(yǎng)基中幾乎不能生長(zhǎng)。菌株Y12在40 ℃條件下，在含體積分?jǐn)?shù)4%乙醇的YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好，在含體積分?jǐn)?shù)6%乙醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)被抑制，OD600nm值下降了16%，在含體積分?jǐn)?shù)8%、10%乙醇的YPD培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng)。菌株Y12在45 ℃條件下，在含體積分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%乙醇的YPD培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng)。說(shuō)明隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株Y12的耐乙醇能力逐漸下降。在40 ℃以下隨著乙醇含量的增高，酵母菌生長(zhǎng)逐漸被抑制，在45 ℃時(shí)酵母菌在含乙醇的培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng)。

2.6 耐高溫產(chǎn)香酵母Y12的產(chǎn)乙醇能力

菌株Y12發(fā)酵液中酒精度及殘?zhí)橇恳?jiàn)表2。

表2 菌株Y12的產(chǎn)乙醇能力Table 2 Ethanol production capacity of strain Y12

由表2可知，與某品牌酵母菌相比，菌株Y12在40 ℃條件下產(chǎn)乙醇能力更強(qiáng)（6.3%vol），殘?zhí)橇扛停?4.43 g/L）。分析原因可能是某品牌酵母的最適生長(zhǎng)溫度和發(fā)酵溫度均不能達(dá)到40 ℃，導(dǎo)致生長(zhǎng)被抑制，產(chǎn)乙醇能力下降。所以酒精度較低（3.9%vol），殘?zhí)橇枯^高（146.32 g/L）。

2.7 耐高溫產(chǎn)香酵母Y12固態(tài)產(chǎn)香試驗(yàn)

耐高溫產(chǎn)香酵母Y12固態(tài)發(fā)酵后，采用GC-MS檢測(cè)其發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分，其GC-MS分析總離子流色譜圖見(jiàn)圖6，產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分種類及含量見(jiàn)表3。

圖6 菌株Y12固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of volatile components of solid-state fermentation products of strain Y12 analysis by GC-MS

由表3可知，從菌株Y12的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測(cè)到揮發(fā)性物質(zhì)12種，包括酯類6種，相對(duì)含量為72.45%，分別是乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙二醇二乙酸酯、乙酸苯已酯；醇類物質(zhì)3種，相對(duì)含量為10.02%，分別是異丁醇、異戊醇、苯乙醇；酸類物質(zhì)只有異丁酸，相對(duì)含量為0.4%；酚類物質(zhì)只有4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，相對(duì)含量為0.22%。其中相對(duì)含量最高的是乙酸乙酯，為39.04%，其次是乙酸苯乙酯（22.9%）。酯類和醇類物質(zhì)是白酒中香氣的主要成分，其中乙酸乙酯是醬酒的重要呈香物質(zhì)。

表3 菌株Y12固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 Results of volatile components of solid-state fermentation products of strain Y12 analysis by GC-MS

3 結(jié)論

從醬香型白酒窖醅中篩選出3株（Y2、Y12、Y27）能在45 ℃條件下正常生長(zhǎng)的產(chǎn)香酵母菌，其中菌株Y12的生長(zhǎng)周期短，代謝速度快，遲滯期為0～2 h，對(duì)數(shù)期為2～6 h，6 h就開始進(jìn)入穩(wěn)定期。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和26S rDNA序列分析鑒定菌株Y12為庫(kù)得畢赤酵母（Pichia kudriavevii）。在乙醇耐受性試驗(yàn)中，菌株Y12的耐乙醇能力達(dá)到6%vol；在產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)中，與某品牌酵母相比，在40 ℃條件下，菌株Y12產(chǎn)酒精能力更好（6.3%vol），殘?zhí)橇扛伲?4.43 g/L）。在產(chǎn)香試驗(yàn)中，運(yùn)用頂空固相微萃取和GC-MS從菌株Y12固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測(cè)出12種揮發(fā)性成分，包括酯類、醇類、酸類和酚類，相對(duì)含量分別為72.45%、10.02%、0.4%和0.22%，其中，乙酸乙酯相對(duì)含量最高（39.04%）。本試驗(yàn)中篩選出的耐高溫產(chǎn)香酵母菌，在耐高溫同時(shí)產(chǎn)香物質(zhì)豐富，在白酒工業(yè)中有良好的應(yīng)用前景。