滕牧洲 馬文麗

·述評·

走近醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的基因芯片技術(shù)

滕牧洲 馬文麗★

生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如寡核苷酸，基因片段，cDNA片段或多肽、蛋白質(zhì)）的微陣列?；蛐酒巧镄酒囊环N。隨著人類基因組計劃的提前完成?；蛐酒夹g(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，其具有高通量、多樣化、自動化、反應(yīng)微型化等突出特點(diǎn)。基因芯片技術(shù)已在基因功能表達(dá)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、疾病病理、臨床診斷、藥物開發(fā)及篩選等研究方面取得重大進(jìn)展。本文簡要介紹基因芯片技術(shù)的基本原理和種類，論述基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

基因；基因芯片技術(shù)；醫(yī)學(xué)研究

隨著人類基因組計劃（human genome project，HGP）的完成以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得到測定，基因序列數(shù)據(jù)庫正在以前所未有的速度迅速增長?；蛐酒鳛橐环N多基因分析的技術(shù)具有獨(dú)一無二的優(yōu)勢，可以同時分析樣品中成千上萬的基因數(shù)據(jù)，這種高通量模式使得基因研究效率也成千上萬倍的突增，因此基因芯片在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中擔(dān)負(fù)著極其重要的使命。該技術(shù)正在醫(yī)學(xué)研究等多個方面被廣泛應(yīng)用。

1 基因芯片技術(shù)原理及合成

基因芯片技術(shù)主要基于雜交測序（sequencing by hybridization，SBH）原理研制而成的一種使待分析樣品通過與芯片中已知堿基順序的DNA片段互補(bǔ)雜交，從而確定樣品中的核酸序列和性質(zhì)，并對基因表達(dá)的量及其特性進(jìn)行分析的技術(shù)。具體來說，首先是將大量的DNA片段或寡核苷酸片段高密度有序的排列在固相載體上，稱之為基因芯片。其次是同時提取待檢樣品的DNA（或mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到熒光標(biāo)記的cDNA）探針，與芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)激光共聚集顯微鏡掃描，用計算機(jī)系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行比對和檢測，可獲得樣品中大量的基因序列和表達(dá)水平的信息［1］。基因芯片技術(shù)由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（southern blotting和northern blotting等）技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如基因表達(dá)譜測定、實(shí)變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等［2］。目前將基因片段固定到支持物的方法總體有兩種：

1．1原位合成法

原位合成法主要為光引導(dǎo)原位合成技術(shù)，它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。該法是在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成寡核苷酸探針陣列，每一個探針都是由A、T、G、C 4個堿基由下而上堆積而成。每一層合成都需要相應(yīng)的掩蓋。在合成堿基單體的5′-羥基末端連接上一個光敏保護(hù)基，利用光照射使羥基脫保護(hù)進(jìn)行DNA的合成在生長的鏈上加上一個堿基這個過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢，該方法可在成千上萬個位點(diǎn)同時進(jìn)行合成來實(shí)現(xiàn)在特定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡核苷酸或寡肽的目的。

1．2點(diǎn)樣合成法

點(diǎn)樣合成法是指將PCR等方法得到的cDNA、寡聚核苷酸片段等用針點(diǎn)或噴點(diǎn)的方法以較高密度互不干擾地印點(diǎn)于經(jīng)過特殊處理的玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜上，并使其與支持物牢固結(jié)合。支持物需預(yù)先經(jīng)過特殊處理，例如多聚賴氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共價結(jié)合的方法將這些生物大分子牢牢地附著于支持物上，從而制備成芯片，然后經(jīng)過紫外線照射交聯(lián)固定。點(diǎn)樣法合成法制作芯片的工藝比較簡單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜科研工作者按照自己的需要靈活機(jī)動地設(shè)計微點(diǎn)陣。

2 基因芯片的種類

按照載體上所點(diǎn)的DNA的種類不同，芯片可分為cDNA和寡核苷酸芯片2種。

2．1cDNA芯片

cDNA芯片制作方法是用PCR方法得到的cDNA片段固定在在相應(yīng)的基片表面上，并把每一類載有cDNA的基片經(jīng)過體外擴(kuò)增，得到大小和序列不同的片段分別經(jīng)過純化后，按矩陣高密度有序的排列在玻片硅晶片或尼龍膜上，制成cDNA芯片。與傳統(tǒng)載體比較，cDNA芯片具備高通量的優(yōu)勢，并且靶基因檢測特異性好。制作技術(shù)較為成熟，成本較低?？捎糜诨虮磉_(dá)差異的檢測。

蛋雞養(yǎng)殖在我們國家已經(jīng)有了很多年的歷史，隨著多年的發(fā)展，蛋雞養(yǎng)殖量已經(jīng)有了很大的提高，蛋雞的品種改良和飼料營養(yǎng)研究也取得了極大的進(jìn)步，蛋雞的飼養(yǎng)周期和產(chǎn)蛋性能都有了明顯的提高，養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)也從小規(guī)模大群體向大規(guī)模集約化的方向轉(zhuǎn)變，但同時也面臨著許多嚴(yán)峻的考驗。

2．2寡核苷酸芯片

寡核苷酸芯片即oligo chip，主要原理與cDNA芯片類似，主要通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交，來檢測對應(yīng)片段是否存在、存在量的多少。它與cDNA芯片的本質(zhì)差別在于寡聚核苷酸芯片固定的探針為特定的DNA寡聚核苷酸片段（探針），而后者為cDNA?；虮磉_(dá)芯片的兩個重要參數(shù)是檢測的靈敏度和特異性。cDNA芯片由于基因長短不同以至Tm值各異，眾多的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難統(tǒng)一，傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制。寡聚核苷酸芯片序列選擇經(jīng)過優(yōu)化，利用合成的一定長度（如20，30，70-mer等）的寡核苷酸單鏈探針代替全長cDNA點(diǎn)樣，制成芯片。其優(yōu)點(diǎn)：無需擴(kuò)增，防止擴(kuò)增失敗影響實(shí)驗；減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；雜交溫度均一，提高雜交效率；減少二級結(jié)構(gòu)。此外，寡核苷酸芯片還可以通過原位合成法制備，而cDNA芯片只能通過后者制備。上述特點(diǎn)使得寡核苷酸芯片的應(yīng)用日益廣泛［3，4］。

3 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用

3．1基因功能表達(dá)研究

基因芯片有能力將基因組全部或某個染色體的全部基因或表達(dá)序列標(biāo)簽裝載到一張芯片上，可以全面檢測一定條件下基因表達(dá)情況，為疾病的診斷的治療提供了有益的信息。

Zhang等［5］通過對乳腺癌患者和健康人群的五個乳腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類分析、Kaplan-Meier分析，發(fā)現(xiàn)BIRC5、CENPA和FAM64A三個基因的高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)。張巖等［6］應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EB病毒陽性胃癌細(xì)胞系與陰性胃癌細(xì)胞系之間，有322條基因的表達(dá)有明顯差異。其中與腫瘤相關(guān)的基因涉及轉(zhuǎn)錄翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附、細(xì)胞增殖和凋亡以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。

分析基因差異表達(dá)并進(jìn)行相應(yīng)的計算，篩選差異表達(dá)的基因，聯(lián)合生物分析系統(tǒng)進(jìn)行基因的功能注釋和關(guān)聯(lián)分析，可明確差異基因的生物學(xué)功能，有助于闡明基因的作用機(jī)制。

3．2基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

生物體的生長發(fā)育是復(fù)雜的動態(tài)過程，而細(xì)胞是這一過程的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能單元。單一細(xì)胞的分裂、決定、分化和凋亡就是復(fù)雜的動態(tài)過程。而細(xì)胞的生理功能通常是由許多基因共同作用的結(jié)果。這些基因之間的相互作用，構(gòu)成了復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過基因芯片研究細(xì)胞信號通路是常用的手段，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、級聯(lián)反應(yīng)、鐵離子通道等相關(guān)的基因群都已有較好的闡明［7］。

3．3檢測基因突變和基因組的多態(tài)性

越來越多的引發(fā)疾病和能預(yù)測疾病的各種基因突變正在被人們逐漸認(rèn)識。許多疾病引發(fā)基因可能會有數(shù)以百計的與表征有關(guān)的特定突變，因而，要求能有同時篩選這些突變的有效方法。在以往，生物研究者多是采用人工測序和自動測序的方法來研究基因突變和多態(tài)性，由于人工測序和自動測序的方法具有一定局限性，很難獲得高精度高分辨率的結(jié)果，這就極大地限制了大規(guī)模、低消耗和自動化的對這種研究的一種需求?；蛐酒夹g(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足?；蛐酒夹g(shù)結(jié)合DNA聚合酶或連接酶能夠獲得更高的檢測準(zhǔn)確率和分辨率?；蛐酒夹g(shù)可規(guī)?；貦z測和分析DNA的變異及多態(tài)性。目前已經(jīng)推出一些突變檢測諸如p53抑癌基因，乳腺癌基因，囊性纖維病基因的診斷試劑盒。

3．4疾病病理研究

疾病的發(fā)生從分子生物學(xué)上都可歸為基因變化的結(jié)果，分別由外源性基因在體內(nèi)的存在情況和內(nèi)源性基因的突變、表達(dá)異常。外源性基因來自感染、移植或基因治療；內(nèi)源性基因突變包括基因擴(kuò)增、基因丟失、基因易位和點(diǎn)突變。通過對基因及其表達(dá)異常分析認(rèn)識疾病，闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律。

Yip等［12］利用基因表達(dá)譜芯片，研究Ⅰ型糖尿病（T1D）的疾病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)了兩個關(guān)鍵基因在此病中的重要作用。實(shí)驗對象為患T1D的非肥胖糖尿病（NOD）模型小鼠和同系無疾病傾向的NOD．B10小鼠，通過檢測兩組小鼠以及患者在特異組織和不同階段的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了Deaf1和Adora1兩個基因，并解釋其對T1D發(fā)病前出現(xiàn)的高血糖癥和β細(xì)胞應(yīng)激中的影響。這一實(shí)驗相比較于以往的全基因組研究，在闡明致病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物和尋求治療策略上都有顯著進(jìn)展。Yoshimura等［13］使用基因表達(dá)譜芯片和定量RT-PCR技術(shù)比較耳蝸頂端、中部及基底中共24，547個基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了Pou4f3，Slc17a8，Tmc1，Crym四個基因的差異表達(dá)，其突變導(dǎo)致聽力損失。并發(fā)現(xiàn)了Emilin-2和Tectb的表達(dá)對耳蝸功能的重要作用。這些實(shí)驗都表明并強(qiáng)調(diào)了研究疾病機(jī)理時，對基因表達(dá)譜分析的重要性。

3．5在臨床疾病診斷中的應(yīng)用

很多疾病都是因基因?qū)е?，常用傳統(tǒng)診斷方法只能對極少數(shù)的基因進(jìn)行診斷和檢測，檢測的效率低下，而且診斷的準(zhǔn)確度也低，影響了該種方法的使用?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)改變了這種狀況，因為基因芯片技術(shù)具有大規(guī)模、高通量和先進(jìn)性等諸多優(yōu)點(diǎn)，這使得基因芯片技術(shù)可以對疾病的診斷更加簡便快捷高效。利用基因表達(dá)譜芯片預(yù)測病情、并將其分型，是基因芯片具有的明顯優(yōu)勢，研究最多的一類疾病為腫瘤［14］。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展往往是正?；虻耐蛔兓蛉笔А┗虻漠惓U(kuò)增和表達(dá)以及多個基因協(xié)同作用的結(jié)果。利用基因芯片可隨時獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)的基因表達(dá)模式同時可以比較正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因，作為藥物篩選的靶標(biāo)［14］。

陶陶等［15］應(yīng)用microRNA基因表達(dá)譜芯片，研究紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞skov3-tr30及其敏感細(xì)胞skov3基因表達(dá)譜，篩選出171個與卵巢癌細(xì)胞化療耐藥相關(guān)microRNA，miR-17～92基因簇與卵巢漿液性癌化療耐藥有關(guān)。根據(jù)這一差異可鑒定并篩查出化療耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞。Harris等［16］研究初始治療的小兒潰瘍性結(jié)腸炎DNA甲基化相關(guān)結(jié)腸黏膜免疫和防御反應(yīng)，應(yīng)用DNA微珠芯片分析兩組患者，其中22位對照組患者，未經(jīng)治療15位羅恩病患者和9位有潰瘍性結(jié)腸炎患者組。基因芯片表達(dá)技術(shù)分析潰瘍性結(jié)腸炎的特異性表達(dá)。發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因包括IFITM1，ITGB2，S100A9，SLPI，SAA1，和STAT3表達(dá)的改變與結(jié)腸粘膜免疫與防御反應(yīng)有關(guān)。Feik等［17］用基因芯片技術(shù)分析31例前列腺癌患者和17例良性前列腺增生患者的激光捕獲顯微切割細(xì)胞mRNA表達(dá)和DNA拷貝數(shù)的變化?？截悢?shù)的數(shù)據(jù)分析顯示，侵略性和非侵略性的腫瘤之間的一些顯著的差異，DNA的拷貝數(shù)改變的在前列腺癌評估中可能具有診斷和預(yù)后價值。Tsai等［18］利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)、qRT-PCR以及western blot等技術(shù)分析骨膜、纖維化和椎間盤退變的關(guān)系，證明骨膜蛋白可能是椎間盤退變新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

3．6藥物的研究與開發(fā)

在尋找新藥時，基因芯片可以對生物體的多個參數(shù)同時進(jìn)行研究以發(fā)掘藥物靶點(diǎn)，同時可以獲取大量其它相關(guān)信息。因此，與其他一元化的分析方法相比較，基因芯片這種集成化的分析手段更有優(yōu)勢。在藥物的篩選中，基因芯片技術(shù)可分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)譜的變化。構(gòu)建基因表達(dá)圖譜，通過基因表達(dá)的增加或降低，分析病理學(xué)、生理學(xué)的原因，高效率的篩選出新的藥物或先導(dǎo)化合物，省略大量的動物實(shí)驗，縮短藥物篩選周期，從而促進(jìn)新藥的研發(fā)。

抗腫瘤藥物的作用機(jī)制及篩選一直是研究熱門。孫亞軍等［19］通過應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植腫瘤組織基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酪絲亮肽能顯著抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生長，抑瘤率為41．34％。酪絲亮肽實(shí)驗組與生理鹽水對照組比較，有33個表達(dá)差異基因，其中21個促進(jìn)腫瘤增殖的基因表達(dá)下調(diào)，12個抑制腫瘤增殖的基因表達(dá)上調(diào)。說明酪絲亮肽具有顯著的抗腫瘤活性。酪絲亮肽作用機(jī)制，可能是通過影響腫瘤細(xì)胞的P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響該通路的下游事件，損傷腫瘤細(xì)胞線粒體，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

胡屹屹等［20］為探討中藥白頭翁湯方劑（PD），探討對細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）損傷的治療作用。加入LPS和白頭翁湯作用12h后，提取總RNA與基因芯片雜交，以檢測基因表達(dá)的變化情況。生物統(tǒng)計學(xué)分析出各組的基因表達(dá)差異，并推測白頭翁湯抗內(nèi)毒素的藥理機(jī)制，可能在于減少炎癥因子的蛋白表達(dá)，抑制凋亡基因的啟動，阻礙內(nèi)毒素信號傳導(dǎo)與受體激活，增加機(jī)體能量代謝和蛋白質(zhì)合成。Laurent等［21］利用基因芯片利用基因芯片對葡萄膜黑色素瘤基因GNAQ，GNA11，GNAS，GNA15，BAP1，和BRAF的突變狀態(tài)進(jìn)行了分析，在免疫缺陷小鼠中建立和維持初級葡萄膜黑色素瘤的移植瘤表現(xiàn)出比在體內(nèi)多次傳代的原發(fā)腫瘤和移植瘤遺傳保護(hù)程度高。這些模型用于葡萄膜黑色素瘤的藥物篩選。Coskun等［22］通過體外受精治療多囊卵巢綜合癥患者，注射5 000 IU或10 000 IU人絨毛膜促性腺激素。收集卵泡液的顆粒細(xì)胞用于RNA分離和使用基因芯片陣列分析。注射人絨毛膜促性腺激素引起顆粒細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，與5 000 IU比較，10 000 IU人絨毛膜促性腺激素導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化很小。Coskun建議使用10 000 IU人絨毛膜促性腺激素的多囊卵巢綜合癥患者應(yīng)重新考慮劑量。

4 展望

基因芯片從它的誕生發(fā)展至今，經(jīng)歷了二十幾年的理論考驗和實(shí)踐驗證，終于形成了一套比較完備的、系統(tǒng)的平臺，并且仍然在滿足市場和科研的需求下不斷地完善。但其存在的缺陷也是相當(dāng)明顯的。首先，基因表達(dá)譜芯片無法檢測出待測基因在多細(xì)胞類型組織中的精確位置，需要借助原位雜交技術(shù)。其次，很多蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能還與蛋白質(zhì)的磷酸化、去磷酸化或甲基化、去甲基化等有關(guān)，因此僅僅檢測mRNA及蛋白的表達(dá)，不能完全說明基因的表達(dá)情況和功能狀態(tài)。另外，其價格不菲和操作標(biāo)準(zhǔn)未統(tǒng)一等原因，仍未能在從實(shí)驗室廣泛地投入到臨床及更廣闊的市場應(yīng)用當(dāng)中。隨著分子生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)的快速發(fā)展以及技術(shù)方法的改進(jìn)，基因芯片一定會在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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A brief introduction of the gene chip in modern medical research

TENG Muzhou,MA Wenli★
(Institute of Genetic Engineering,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China，510515)

Biochip is a high density microarry with biological information molecule(such as oligo, gene segments,cDNA fragment,polypeptide and protein)fixed on media supported by solid phase.Gene chip is one of the biochip.Along with the ahead completion of Human Genome Project(HGP),gene chip technology becomes widely used in research of life sciences,taking the high throughput,diversity, automation,microminiaturized reaction as its significant characteristic.Gene chip technology has achieved great progress in researching the expression of genetic function,genetic regulation of network,nosopathology clinical diagnosis,medicinal development and screening and so on.This paper mainly introduces the basic theory and catalog of gene chip technology,and then discusses its application in medical field.

Gene;Gene chip technology;Medical research

廣東省引進(jìn)領(lǐng)軍人才專項（C1030925）

南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：馬文麗，E-mail：wenli＠fimmu．com