翁玉英倪琛林秀鳳鄭苗黃海龍

·論著·

不同標(biāo)本巨細(xì)胞病毒檢測(cè)在診斷小兒人巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用

翁玉英★倪琛1林秀鳳1鄭苗1黃海龍2

目的探討尿液、淋巴細(xì)胞和母乳的HCMV-DNA檢測(cè)以及血清HCMV-IgM檢測(cè)在小兒人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染診斷中的意義。方法用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)189例疑似HCMV感染患兒尿液、淋巴細(xì)胞和母乳的HCMV-DNA，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其血清HCMV-IgM，并分年齡分性別對(duì)其陽性率進(jìn)行分析比較。結(jié)果新生兒組母乳HCMV-DNA陽性檢出率（60．3％）顯著高于尿液（5．2％，P＜0．001）和淋巴細(xì)胞（12．1％，P＜0．001），也顯著高于血清HCMV-IgM陽性率（3．4％，P＜0．001）；嬰兒組母乳（48．1％）與尿液（55．0％）HCMV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但兩者均顯著高于淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％，P＜0．001）；嬰兒組的尿液HCMV-DNA、血清HCMV-IgM陽性率均顯著高于新生兒組（P＜0．01）；兩組各指標(biāo)男女陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關(guān)（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000）。結(jié)論聯(lián)合尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測(cè)有助于患兒HCMV感染的輔助診斷；在無法聯(lián)合檢測(cè)的條件下，嬰兒首選尿液HCMV-DNA檢測(cè)可獲得較高檢出率；母乳HCMVDNA檢測(cè)并正確喂養(yǎng)有助于預(yù)防HCMV感染。

人巨細(xì)胞病毒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；嬰兒；新生兒

人巨細(xì)胞病毒感染癥是由人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）引起的先天性或后天性感染。我國是人巨細(xì)胞病毒感染的高發(fā)區(qū)，平均感染率高達(dá)80％～90％。孕婦在妊娠期間的感染多無明顯癥狀和體征，表現(xiàn)為隱性感染，少數(shù)感染后可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等；而對(duì)于免疫機(jī)制發(fā)育不成熟的新生兒和嬰兒，則可產(chǎn)生肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等嚴(yán)重的感染癥狀［1，2］。

因此，小兒HCMV感染的早期診斷和治療非常重要。本文用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）同時(shí)檢測(cè)疑似HCMV感染患兒尿液、淋巴細(xì)胞和母乳的HCMV-DNA，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其血清HCMV-IgM，并分年齡、性別對(duì)各檢測(cè)陽性率進(jìn)行分析比較，探討上述不同標(biāo)本不同檢測(cè)指標(biāo)在小兒HCMV感染診斷中的意義。

1 對(duì)象與方法

1．1對(duì)象

研究對(duì)象為2013年7月～2014年6月在福建省婦幼保健院新生兒科和兒科住院治療的疑似HCMV感染患兒189例，年齡在1周歲以內(nèi)。其中新生兒組（年齡在0～28天）58例，男34例，女24例；嬰兒組（年齡在29天～12月）131例，男81例，女50例。收集其EDTA抗凝的全血、尿液和母乳標(biāo)本用于HCMV-DNA檢測(cè)，血清標(biāo)本用于HCMV-IgM檢測(cè)。

1．2主要試劑和儀器

人巨細(xì)胞病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，由美國AB7500熒光定量PCR儀檢測(cè)；人巨細(xì)胞病毒IgM抗體由意大利Liaison全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測(cè)。

1．3方法

1．3．1FQ-PCR法檢測(cè)淋巴細(xì)胞HCMV-DNA

加1 mL EDTA抗凝全血到裝有1 mL生理鹽水的離心管中，輕微混勻，并將此2 mL混合血液沿試管壁緩緩加入到裝有1 mL淋巴細(xì)胞分離液的試管中，不能震蕩混勻，2 000 rpm離心20分鐘，用加樣槍吸出中間的淋巴細(xì)胞層于離心管中，12 000 rpm離心5分鐘，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增條件和步驟嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書，下同。

1．3．2FQ-PCR法檢測(cè)尿液HCMV-DNA

將尿液標(biāo)本輕輕顛倒混勻，用加樣槍吸100 μL加入到裝有100 μL DNA濃縮液的離心管中，震蕩混勻，12 000 rpm離心10分鐘，去上清，于沉淀物中加入20 μL DNA提取液打勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴(kuò)增。

1．3．3FQ-PCR法檢測(cè)乳汁HCMV-DNA

取1 mL乳汁于離心管中，12 000 rpm離心5分鐘，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴(kuò)增。

1．3．4化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清HCMV-IgM

取患兒靜脈血于促凝管中，凝固后離心取上清。其檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書和儀器操作規(guī)程。

1．4結(jié)果判斷

HCMV-DNA以增長(zhǎng)曲線呈典型的S曲線且實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果＞500 copies／mL為陽性，否則為陰性；HCMV-IgM以≥18 U／mL為陽性，＜18 U／mL為陰性。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在陰、陽性對(duì)照和室內(nèi)質(zhì)控在控的前提下獲得。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法，陽性率的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1新生兒組尿液、淋巴細(xì)胞和母乳HCMVDNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率比較

表1所示，新生兒組58例疑似HCMV感染的患兒中，母乳HCMV-DNA陽性檢出率（60．3％）顯著高于尿液（5．2％，χ2＝40．07，P＜0．001）和淋巴細(xì)胞（12．1％，χ2＝29．26，P＜0．001），也顯著高于血清HCMV-IgM陽性率（3．4％，χ2＝43．22，P＜0．001）。而尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA與血清HCMVIgM陽性檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

2．2嬰兒組尿液、淋巴細(xì)胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率比較

表1所示，嬰兒組131例疑似HCMV感染的患兒中，母乳（48．1％）與尿液（55．0％）HCMV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1．24，P＞0．05），但兩者均顯著高于淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率（22．1％；分別為：χ2＝19．37，P＜0．001；χ2＝29．79，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％；分別為：χ2＝15．87，P＜0．001；χ2＝25．51，P＜0．001）。

2．3新生兒組和嬰兒組HCMV-DNA和HCMVIgM陽性檢出率比較

嬰兒組的尿液HCMV-DNA陽性率、血清HCMV-IgM陽性率均顯著高于新生兒組（分別為：χ2＝41．64，P＜0．001；χ2＝11．99，P＜0．01），而淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率、母乳HCMV-DNA陽性率則與新生兒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為：χ2＝2．64，P＞0．05；χ2＝2．42，P＞0．05）。

2．4不同性別HCMV-DNA和HCMV-IgM陽性檢出率比較

在新生兒組及嬰兒組內(nèi)，男患兒與女患兒的尿液、淋巴細(xì)胞、母乳HCMV-DNA陽性率和血清HCMV-IgM陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

表1189 例患兒尿液、淋巴細(xì)胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率（n＝189）Table 1Positive rates of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine，blood lymphocytes and mother's breast milk（n＝189）

2．5母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關(guān)性

在母乳HCMV-DNA陽性的98例樣本中，尿液HCMV-DNA陰性的30例，淋巴細(xì)胞HCMVDNA陰性的64例，血清HCMV-IgM陰性的68例；在母乳HCMV-DNA陰性的91例樣本中，尿液HCMV-DNA陽性的7例，淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性的2例，血清HCMV-IgM陽性的4例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細(xì)胞的HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)和P值分別為：r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000。參見表2。

表2 母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關(guān)性（n＝189）Table 2 Relations of HCMV DNA positive rate in mother's breast milk with those in urine，blood lymphocytes and HCMV IgM in sera（n＝189）

3 討論

人巨細(xì)胞病毒（HCMV）是人類先天性病毒感染中最常見的病原體之一［3］。人體感染HCMV以后3～5天即可出現(xiàn)IgM抗體，其陽性是診斷早期感染的可靠指標(biāo)，并表明為活動(dòng)性感染［4］，但其產(chǎn)生的多寡受體內(nèi)HCMV感染量、宿主的免疫反應(yīng)狀態(tài)等影響。本研究結(jié)果顯示，嬰兒組尿液HCMV-DNA陽性率（55．0％）顯著高于淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％，P＜0．001）。一方面，這可能是由于新生兒和嬰兒機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，產(chǎn)生IgM的能力較弱，導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)，同時(shí)IgM陽性也可能是受類風(fēng)濕因子和IgG競(jìng)爭(zhēng)抗原的干擾而造成的假陽性［5，6］；而另一方面，尿液HCMV-DNA陽性率高可能是由于HCMV最易侵犯腎臟和肝膽系統(tǒng)管道上皮細(xì)胞，HCMV在腎小球和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且腎臟具有濃縮功能，使尿液有一定濃度的HCMV排出。

HCMV是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒屬，對(duì)宿主或組織培養(yǎng)細(xì)胞有明顯的種屬特異性，HCMV可存在于人體內(nèi)皮、上皮、平滑肌等多種細(xì)胞中，肝、肺、腎、胰是HCMV的主要靶器官［7］。CMV感染者是唯一的傳染源，病毒可從宿主尿液、宮頸及陰道分泌物、乳汁、精液和血液等多個(gè)部位排出此病毒［8］。本研究結(jié)果顯示，新生兒組尿液HCMVDNA陽性率僅為5．2％，與de Vries等［9］報(bào)導(dǎo)的8．2％接近，且與淋巴細(xì)胞HCMV-DNA（12．1％）和血清HCMV-IgM（3．4％）陽性檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。這是否是由于新生兒腎臟濃縮功能弱而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，還有待于進(jìn)一步研究。de Vries等［9］認(rèn)為對(duì)于免疫力不全的新生兒，尿液HCMV-DNA定量PCR比病毒培養(yǎng)具有更高靈敏度，也可作為診斷HCMV感染的金標(biāo)準(zhǔn)。

母乳HCMV-DNA陽性證明患兒母親有HCMV感染并從乳汁排毒。本研究結(jié)果顯示，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細(xì)胞HCMVDNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關(guān)（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000），這提示患兒HCMV感染與母乳傳播有關(guān)。但從實(shí)驗(yàn)中我們也看到，母乳HCMV-DNA陰性患兒也有尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA陽性和血清HCMV-IgM陽性的病例，而且有的患兒特別是新生兒母乳喂養(yǎng)時(shí)間很短甚至缺乏。這也證實(shí)母乳傳播不是患兒HCMV感染唯一途徑，它也可通過經(jīng)產(chǎn)道感染、胎盤傳播、接觸傳播或醫(yī)源性傳播［8，10］。母乳（特別是初乳）營(yíng)養(yǎng)豐富，是嬰兒的最佳食品，是任何乳制品不可替代的，對(duì)嬰兒健康成長(zhǎng)十分有益。對(duì)已感染HCMV的嬰兒可繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，無需處理；對(duì)早產(chǎn)兒和低出生體重兒則需將帶病毒母乳-20℃凍存1 d，再加巴斯德滅菌法（62．5℃）消除病毒感染性后再喂養(yǎng)［11，12］。綜上所述，在嬰兒組，尿液HCMV-DNA陽性率顯著高于淋巴細(xì)胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率，但也有發(fā)現(xiàn)尿液HCMV-DNA陰性而后兩者陽性的病例；在新生兒組，HCMV-DNA或HCMV-IgM陽性的9例患兒中，僅1例尿液HCMV-DNA、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM三者均陽性。單一標(biāo)本或單一指標(biāo)容易漏檢HCMV。HCMV感染具有間歇性、多部位排毒的特點(diǎn)，且因感染部位不同和個(gè)體差異，在不同標(biāo)本所釋放的病毒量也不同。因此，聯(lián)合尿液、淋巴細(xì)胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測(cè)有助于患兒HCMV感染的輔助診斷。在無法聯(lián)合檢測(cè)的條件下，嬰兒首選尿液HCMV-DNA檢測(cè)可獲得較高檢出率?；純篐CMV感染與母乳傳播有關(guān)，母乳HCMV-DNA檢測(cè)并正確喂養(yǎng)有助于預(yù)防HCMV感染。

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Diagnostic significance of detections of human cytomegalovirus in different specimens for baby infection

WENG Yuying★,NI Chen,LIN Xiufeng,ZHENG Miao,HUANG hailong
(1.Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001; 2.Prenatal Diagnosis Center,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001)

ObjectiveTo study the diagnostic significance of detection of human cytomegalovirus (HCMV)IgM in sera,and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk for baby infection.MethodsChemiluminescence technology was used to detect the specific HCMV IgM antibody in sera and fluorescent quantitative PCR was used to detect HCMV DNA simultaneously in urine,blood lymphocytes and the mother's breast milk of 189 infants with suspected HCMV infection.The positive rates in these specimens were analyzed in either newborn group(less than 28 days old)or infant group(from 29 days to 12 months old),as well as boy group and girl group.ResultsIn newborn group,the positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk(60.3％)was higher than those both in urine(5.2％,P＆lt;0.001)andin blood lymphocytes(12.1％,P＆lt;0.001).In infant group,no statistical difference was detected between the positive rates of HCMV DNA in mother's breast milk(48.1％)and that in urine(55.0％),which were higher than that in blood lymphocytes(22.1％)and the positive rate of HCMV IgM in sera(24.4％).In infant group,the positive rate of HCMV DNA in urines and that of HCMV IgM in sera were higher than those in newborn group(P＆lt;0.01).No statistical difference between boy group and girl group was detected in all specimens.The positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk showed significant positive correlations with those of all other specimens(P＆lt;0.001).ConclusionsCombined detection of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk would contribute to auxiliary diagnosis of baby with HCMV infection.If it is not available to detect all these samples,detection of HCMV DNA in urine of infant may be the first choice.Detection of HCMV DNA in mother's breast milk and breastfeeding in a correct way would contribute to the prevention of HCMV infection.

Human cytomegalovirus;Fluorescent quantitative PCR;Infant;Newborn

福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01311）；福建省衛(wèi)計(jì)委中青年骨干人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目（2013-2QN-2D-6）

1．福建省婦幼保健院檢驗(yàn)科，福建，福州350001 2．福建省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建，福州350001

★通訊作者：黃海龍，E-mail：hl-hai＠163．com