郭新榮，李 晉，馬 琳，王振中，蕭 偉，常艷旭，

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001）

·中藥研究·

青蒿愈傷組織的誘導(dǎo)及化學(xué)成分變化規(guī)律研究*

郭新榮1，李 晉1，馬 琳1，王振中2，蕭 偉2，常艷旭1，2

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001）

[目的]建立青蒿愈傷組織快速繁殖的適宜培養(yǎng)基，測(cè)定其生長(zhǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量變化。[方法]無(wú)菌條件下切取花序、葉和葉柄為外植體，接種于MS添加不同激素組合的培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)及繼代增殖培養(yǎng)，測(cè)定奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量。[結(jié)果]建立了青蒿花序、葉和葉柄愈傷組織快速繁殖的適宜培養(yǎng)基，繪制相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線，并確定了生長(zhǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量變化及最佳采收期。[結(jié)論]通過(guò)組織培養(yǎng)方式可以成功獲得青蒿愈傷組織生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，對(duì)傳統(tǒng)中藥青蒿培養(yǎng)體系優(yōu)化及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行探索提供了一個(gè)新途徑。

青蒿；組織培養(yǎng)；奎寧酸；香豆素；次生代謝產(chǎn)物

青蒿載于西漢的《五十二病方》，為菊科黃花蒿(Artemisia annua L.)地上全草，廣泛分布于中國(guó)的重慶、廣西、四川、山東、江蘇等省份，具有抗虐、抗病毒、抗血吸蟲(chóng)、抗菌，抗內(nèi)毒素、活血?dú)⒕拖祖?zhèn)痛等作用。目前，青蒿的化學(xué)成分主要包括香豆素類、奎寧酸類、黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類化合物和揮發(fā)油等。香豆素類包括莨菪亭、東莨菪內(nèi)酯、香豆素、7-甲氧基香豆素等[1-3]，具有解熱降溫等作用?？鼘幩犷愑芯G原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B等[4-5]，具有抗氧化、抗菌等作用。揮發(fā)油具有清虛熱、涼血、除骨蒸、解暑等功效[6-7]。倍半萜內(nèi)酯青蒿素以其高效、速效、低毒的優(yōu)點(diǎn)被世界衛(wèi)生組織稱為是世界上唯一有效的抗瘧藥物。黃酮類化合物具有抗氧化活性等[8-11]，可促進(jìn)青蒿素與血晶素的反應(yīng)，增強(qiáng)青蒿素的抗瘧性。上述研究表明，青蒿化學(xué)成分具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

目前青蒿化學(xué)成分主要從藥材全株中提取，產(chǎn)量受到地理環(huán)境和季節(jié)的限制，其需求量大，且有效成分含量低，不能滿足市場(chǎng)需求。為解決這一難題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青蒿的育種工作進(jìn)行了大量探索。其中組織培養(yǎng)技術(shù)以其不受自然條件限制，能加速育種進(jìn)程且不破壞自然資源等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)青蒿新品種的培育和推廣具有其他方法無(wú)法替代的優(yōu)越性。焦小珂等[12]對(duì)青蒿同源四倍體的誘導(dǎo)及農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明應(yīng)用多倍體育種技術(shù)，可以大幅度提高藥材產(chǎn)量，四倍體植株農(nóng)藝性狀較二倍體有明顯的優(yōu)越性。對(duì)青蒿花藥培養(yǎng)加以研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿花藥培養(yǎng)最適培養(yǎng)基是6-BA 1 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L或6-BA1mg/L+NAA0.3mg/L，無(wú)需低溫前處理和高溫后處理，即可通過(guò)青蒿花藥培養(yǎng)得到單倍體胚[13]。對(duì)青蒿叢生芽誘導(dǎo)影響因素加以研究，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)叢生芽的激素組合是6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L，青蒿叢生芽的誘導(dǎo)及青蒿素的生物合成可以通過(guò)理化因子有效地進(jìn)行調(diào)控[14]。這些對(duì)青蒿資源開(kāi)發(fā)、保護(hù)和新品種的選育都有重要意義。

本研究擬通過(guò)組織培養(yǎng)方式，獲得青蒿愈傷組織生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，結(jié)合超高效液相色譜（UPLC）方法，同時(shí)定量分析青蒿愈傷組織中奎寧酸類化合物和香豆素化合物類化合物，以期為青蒿愈傷組織培養(yǎng)的相關(guān)研究提供技術(shù)原理和工藝基礎(chǔ)，為大規(guī)模生產(chǎn)青蒿次生代謝產(chǎn)物創(chuàng)造技術(shù)基礎(chǔ)條件，同時(shí)為今后青蒿培養(yǎng)體系優(yōu)化和綜合利用的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供借鑒。

1 試劑及方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 青蒿種子取自江蘇省連云港市，于天津中醫(yī)藥大學(xué)室外栽培得到植株。

1.2儀器與試劑 SPX-300I-G型光照培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），ZXC型紫外消毒車（江蘇巨光光電科技有限公司），SWCJ-2F型雙面凈化工作臺(tái)、Waters ACQUITYTMUltra Performance LC（美國(guó)Waters公司，包括二元梯度泵、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、EMPOWER化學(xué)工作站），SB-1000 YDTD超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、水（超純水）、甲酸（色譜級(jí)）、6-芐氨基嘌呤（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），2-4-二氯苯氧乙酸（上海藍(lán)季科技有限公司，SigmaD7299）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1愈傷組織消毒 參照文獻(xiàn)[15]對(duì)青蒿外植體的消毒條件，將田間栽培的青蒿，截取頂端約5～ 10 cm處生長(zhǎng)能力較旺盛的帶葉莖段及未開(kāi)放花序，先將其用洗衣粉水輕輕揉搓除去表面污垢，再將其用干凈的紗布包裹，置于流動(dòng)自來(lái)水中沖洗2 h左右，紫外滅菌30 min，5%乙醇消毒30 s，帶葉莖段用0.1%升汞滅菌10 min，然后在滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿上將其切成3～5 cm的小段。未開(kāi)放花序用0.1%升汞滅菌改為5 min[16]。

1.3.2愈傷組織培養(yǎng) 1）愈傷組織的誘導(dǎo)：在無(wú)菌條件下將已消毒的青蒿花序、花枝及葉片剪碎，分別接種于含2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上[15-17]，在25℃條件下避光培養(yǎng)15 d，誘導(dǎo)愈傷組織。2）繼代培養(yǎng)：采用2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基對(duì)花愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用2，4-D0.5mg/L+6-BA 1 mg/L培基養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)葉與葉柄愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲得性狀穩(wěn)定的愈傷組織。

1.3.3愈傷組織的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量生長(zhǎng)倍增曲線的繪制 按已確定的最優(yōu)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方配制固體培養(yǎng)基，滅菌分裝于培養(yǎng)皿中。將切好的脆散性愈傷組織稱質(zhì)量后接種于編號(hào)的培養(yǎng)皿中，記錄m1。 25℃下暗培養(yǎng)，每3～4 d取樣1次，每次取樣3瓶，稱取愈傷組織鮮質(zhì)量，記錄m2。將愈傷組織烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量記錄m3。每次取樣的愈傷組織鮮質(zhì)量與干質(zhì)量倍增值的計(jì)算方法：

愈傷組織鮮質(zhì)量倍增值F=（m2-m1）/m1

愈傷組織干質(zhì)量倍增值D=m3/m2

依據(jù)愈傷組織鮮質(zhì)量與干質(zhì)量倍增值的平均值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4愈傷組織樣品處理方法 將樣品置于烘箱中，60℃烘至恒重，用瓷乳缽研磨至粉末狀。精密稱取0.1 g樣品，加10 mL 60%的甲醇，超聲提取50 min,靜置，以14 000 r/min，10 min離心2次，取上清液用UPLC分析方法進(jìn)行化學(xué)成分測(cè)定。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解后，配制各濃度混標(biāo)，分別取1 μL注入U(xiǎn)PLC，記錄色譜圖。以進(jìn)樣濃度（X）與峰面積（Y）作最小二乘法線性回歸，獲得回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇 選擇以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[15-16，18]，通過(guò)對(duì)不同比例的2，4－D與6-BA組合優(yōu)化，以誘導(dǎo)率為指標(biāo)，考察了不同的培養(yǎng)基對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)MS+2，4-D0.1mg/L+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基，對(duì)青蒿葉片、葉柄和花序的誘導(dǎo)率為100%，見(jiàn)表1。因此選擇MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L作為青蒿不同外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在4～5 d時(shí)，葉片在MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上開(kāi)始卷曲，葉柄在接觸培養(yǎng)基部位出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，花序在接觸培養(yǎng)基部出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，部分出現(xiàn)淡白色愈傷組織，7～8 d時(shí)3種外植體出現(xiàn)淡綠色愈傷組織小團(tuán)塊。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)青蒿外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 %

2.2繼代培養(yǎng)基的選擇 以愈傷組織褐變率為指標(biāo)，考察了不同培養(yǎng)基對(duì)不同外植體（葉、葉柄和花序）繼代培養(yǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)當(dāng)采用2，4－D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L最為花序的愈傷組織繼代培養(yǎng)基時(shí)，幾乎無(wú)褐變現(xiàn)象，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，因此選擇2，4－D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L作為花序的愈傷組織繼代培養(yǎng)基。對(duì)于葉、葉柄在MS+2，4-D 0.5 mg/L +6-BA 1 mg/L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)較好，故選定其為葉和葉柄的繼代培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

2.3愈傷組織生物量變化規(guī)律研究 選擇長(zhǎng)勢(shì)較好1.0 g淡黃色的愈傷組織，接種培養(yǎng)上，每3～4 d取樣1次，稱鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。以愈傷組織鮮質(zhì)量增殖系數(shù)、干質(zhì)量生長(zhǎng)倍增值的平均值為縱坐標(biāo)，取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制不同外植體愈傷組織生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。從圖1中可知不同外植體愈傷組織干質(zhì)量與鮮質(zhì)量變化規(guī)律具有一致性。葉柄和葉基本符合“S”型曲線特征。在生長(zhǎng)周期內(nèi)，明顯分為4個(gè)時(shí)期：延遲期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和下降期。葉柄在0～ 12 d為生長(zhǎng)滯后期，接著13～21 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，22～25 d則為穩(wěn)定期，在23 d即達(dá)到其最大生長(zhǎng)量。葉在前4 d鮮質(zhì)量變化不明顯，接種后第10天細(xì)胞從延遲期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)，第20天時(shí)達(dá)到1.98倍鮮質(zhì)量生長(zhǎng)量，以后細(xì)胞培養(yǎng)物鮮質(zhì)量增長(zhǎng)速度放緩，21～25 d為下降期，20天可達(dá)到最大生長(zhǎng)量，如不及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)將停止。而花的愈傷組織延遲期較短，第3天開(kāi)始即呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第13天即達(dá)到最大生長(zhǎng)量，鮮質(zhì)量增殖系數(shù)達(dá)到2.75，在21 d鮮質(zhì)量有明顯增加，但此時(shí)愈傷組織褐變較多，含水量增大不宜再進(jìn)行繼代培養(yǎng)，因此以生物量為指標(biāo)，外植體葉柄和葉的愈傷組織的最大生物量在20 d左右，而花的的愈傷組織在13 d左右。

2.4愈傷組織中有效成分變化規(guī)律研究

2.4.1曲線標(biāo)準(zhǔn)的建立 本研究選擇了奎寧酸類化合物和香豆素化合物為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了不同外植體中化學(xué)成分的變化規(guī)律。利用UPLC的分析方法，對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行測(cè)定，獲得各化學(xué)成分的峰面積，建立了各種化學(xué)成分的線性回歸方程，如表2所示，各化合物線性關(guān)系良好。

表2 7種化合物的線性范圍及回歸方程

2.4.2愈傷組織中化學(xué)成分含量測(cè)定 取不同培養(yǎng)天數(shù)的愈傷組織制備供試品溶液，注入U(xiǎn)PLC，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算青蒿中各種化學(xué)成分的含量，見(jiàn)表3、表4、表5。從表3中可知，異綠原酸A為青蒿花序愈傷組織主要成分，綠原酸與異綠原酸A含量在第3天達(dá)到最高值，新綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸C在第13天達(dá)到最高值，而隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯含量則在第17天達(dá)到峰值。

從表4可知，異綠原酸A為青蒿葉柄愈傷組織中的主要成分，與新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸C在第3天達(dá)到最高值，在23 d出現(xiàn)其次高峰，東莨菪內(nèi)酯在第17天達(dá)到峰值，而異綠原酸B在第23天時(shí)含量最高。

從表5可知，異綠原酸A為青蒿葉愈傷組織中的主要成分，其含量最高，與新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C均在第17天時(shí)含量最高，隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯則在第13天含量最高。

2.5不同愈傷組織中有效成分積累規(guī)律比較研究

次生代謝是植物為了適應(yīng)特定的生活環(huán)境或受到病原微生物侵染后，產(chǎn)生并積累，用以增強(qiáng)自身的抵抗力，并不是細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。但與植物的抗病、抗逆有關(guān)，在提高植物的防御能力和處理生態(tài)環(huán)境關(guān)系上有著重要的角色。而中藥中的次生代謝產(chǎn)物則常常作為主要的藥效成分，并在中藥道地性的形成上有很重要的應(yīng)用[18]。本實(shí)驗(yàn)以青蒿愈傷組織中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和東莨菪內(nèi)酯為主要的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量研究。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間的花序愈傷組織中化學(xué)成分含量 %

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間的葉柄愈傷組織中化學(xué)成分含量 %

表5 不同培養(yǎng)時(shí)間的葉愈傷組織中化學(xué)成分含量 %

累積含量（μg）=愈傷組織百分含量×愈傷組織干質(zhì)量收獲量（g）

2.5.1花序愈傷組織有效成分變化規(guī)律

對(duì)于花的愈傷組織而言，新綠原酸和綠原酸在第21天達(dá)到最高值，而異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C在第10天達(dá)到最高值，隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯在第17天達(dá)到最高值，其中異綠原酸B和異綠原酸A在21 d時(shí)又有回升趨勢(shì)，但此時(shí)愈傷組織開(kāi)始褐變，含水量增大，生長(zhǎng)狀態(tài)不好，不宜再做繼代培養(yǎng)，見(jiàn)表6。

2.5.2葉柄愈傷組織有效成分變化規(guī)律 對(duì)于葉柄的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸A在第23天達(dá)到最高值，隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯在第17天達(dá)到最高值，異綠原酸C在21 d達(dá)到最高峰。見(jiàn)表7。

表6 花序愈傷組織中化學(xué)成分的累積變化 μg/g

對(duì)于葉的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B在第17天達(dá)到最高值，異綠原酸A和異綠原酸C在第13天達(dá)到最高值，東莨菪內(nèi)酯在第10天達(dá)到最高值，見(jiàn)表8。

結(jié)合愈傷組織生長(zhǎng)曲線變化規(guī)律與有效成分變化，發(fā)現(xiàn)花序愈傷組織次生代謝產(chǎn)物新綠原酸與綠原酸生長(zhǎng)曲線變化一致，而異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C則提前到達(dá)最大收獲量，隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯則向后推遲，其中異綠原酸B、異綠原酸A在21 d時(shí)又有回升，其主要原因可能是細(xì)胞開(kāi)始向褐變發(fā)展，從而促進(jìn)了奎寧酸類次生代謝產(chǎn)物的積累。對(duì)于葉柄的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C與生長(zhǎng)曲線變化一致，隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯在第17 d達(dá)到最值，在21 d后各個(gè)化合物均達(dá)到穩(wěn)態(tài)，可作為最佳的繼代培養(yǎng)愈傷組織。對(duì)于葉的愈傷組織而言，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、在第17天達(dá)到最高值，而異綠原酸A和異綠原酸C則在第13天即達(dá)到最佳收獲期，可能是細(xì)胞高度脫分化抑制了次生代謝產(chǎn)物積累的原因造成的。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)添加外源性激素2，4-D和6-BA成功的誘導(dǎo)出了青蒿花序、葉和葉柄的愈傷組織，呈現(xiàn)出淡黃色，結(jié)構(gòu)疏松且生長(zhǎng)迅速，易于分離的特點(diǎn)，將此愈傷組織進(jìn)行數(shù)次繼代，得到遺傳性狀穩(wěn)定的愈傷組織。其中花序、葉和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基均為2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，而繼代培養(yǎng)基略有變化，葉和葉柄的繼代培養(yǎng)基更改為2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1 mg/L?；ㄐ蛴鷤M織生長(zhǎng)周期最短，奎寧酸類化合物在13 d左右即可得到較高的累積量，而東莨菪內(nèi)酯則在17 d為最高的收獲量。葉柄的愈傷組織的各化合物含量及累積量均最高，奎寧酸類化合物在21 d左右為最佳收獲期，而東莨菪內(nèi)酯則在17 d達(dá)到最高量。結(jié)合細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的積累和細(xì)胞生長(zhǎng)周期，建議以葉柄為外植體，以MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1 mg/L為繼代培養(yǎng)基，生長(zhǎng)周期為21 d可獲得青蒿次生代謝產(chǎn)物含量最高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好的愈傷組織，為傳統(tǒng)中藥青蒿培養(yǎng)體系優(yōu)化及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行探索提供了一個(gè)新途徑。

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表7 葉柄愈傷組織中化學(xué)成分的累積變化 μg/g

表8 葉愈傷組織中化學(xué)成分累積變化 μg/g

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Establishment of rapid callus proliferation culture system and evaluating content of secondary metabolite in Herba Artemisiae Annuae

GUO Xin-rong1,LI Jin1,MA Lin1,WANG Zhen-zhong2,XIAO Wei2,CHANG Yan-xu1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2 Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222001,China）

[Objective]To establish the rapid callus proliferation culture system of Herba Artemisiae Annuae and determine the content of phenylpropionic acids and coumarins.[Methods]The inflorescence,leaf and petiole were cut down and selected as explant and induced into callus under sterile conditions.Then,the callus was planted in MS with different combinations of different hormones.Finally,the content of phenylpropionic acid and coumarins was determined.[Results]The rapid callus proliferation culture system of Herba Artemisiae Annuae was established successfully by tissue culture.Kinetics of growth accumulation and the best harvest of phenylpropionic acid and coumarins biosynthesis were evaluated.[Conclusion]Kinetics of growth accumulation of secondary metabolites of Artemisia Annue can be successfully established by tissue culture.These methods provide a new way to explore the variation of the secondary metabolites in culture system optimization and industrial scale production of Artemisia Annua.

Artemisia annua;tissue culture;quininic acid;coumarin compounds;secondary metabolites

R285.5

：A

：1673－9043（2014）04－0219-06

2014-02-15）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.09

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2010 ZX09502-005）；中國(guó)博士后特別基金資助項(xiàng)目（2012 T50239）；江蘇省博士聚集計(jì)劃；天津市科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（10ZCZDSY12400）。

郭新榮（1986－），女，碩士研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com；蕭 偉，E-mail: xiaowei@163.com。