王艷明，杜守穎，王亞靜，張德芹，孫士真

（1.天津中醫(yī)藥大學 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2.哈爾濱醫(yī)科大學（大慶），大慶 163319；3.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102）

Plackett-Burman設計篩選及單因素實驗優(yōu)化沖和凝膠處方組成*

王艷明1，2，杜守穎1，3，王亞靜1，張德芹1，孫士真1

（1.天津中醫(yī)藥大學 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2.哈爾濱醫(yī)科大學（大慶），大慶 163319；3.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102）

[目的]優(yōu)化沖和凝膠的處方。[方法]以黏度、芍藥苷與蛇床子素穩(wěn)定性為指標，通過Plackett-Burman設計篩選處方的主要影響因素。針對影響因素，采用單因素實驗設計進一步優(yōu)化沖和凝膠的處方。[結果]篩選實驗表明，卡波姆、載藥量、甘油、pH值為制劑黏度主要影響因素；pH值、亞硫酸氫鈉為芍藥苷穩(wěn)定性的主要影響因素。通過對各因素優(yōu)化，最終制劑處方為1.5%卡波姆981、12%甘油、0.175%亞硫酸氫鈉、三乙醇胺調節(jié)pH值4.5～6.0，載藥量20%～30%。[結論]經(jīng)驗證，優(yōu)化的處方考察各項指標符合制劑要求。

Plackett-Burman設計；沖和凝膠；處方優(yōu)化

中藥凝膠劑系指提取物與適宜基質制成具有凝膠特性的半固體或是稠厚液體制劑。凝膠劑的基質中通常加入保濕劑、防腐劑、抗氧劑、透皮促進劑等附加劑[1]。中藥提取物組成復雜，并且要求凝膠基質載藥量適度、黏度、保濕性、藥物的穩(wěn)定性、pH值合格[2]。沖和凝膠主要成分為赤芍、白芷、石菖蒲、昆明山海棠等中藥提取物，主要用于糖尿病足的治療。本研究通過篩選合適的基質、載藥量、保濕劑、pH值等指標，制備合格的凝膠劑。Plackett-Burman設計（以下簡稱P-B設計）[3-4]是一種經(jīng)濟而有效的2水平實驗方法，可以用較少的實驗達到分析各因素主效應的效果。通過P-B設計可以快速的從眾多影響因素中篩選出對制劑黏度、芍藥苷和蛇床子素含量變化（即穩(wěn)定性）等指標有顯著影響的因素，從而達到篩選的目的，避免在后期的優(yōu)化實驗中由于部分因子不顯著而浪費實驗資源[5]。針對影響因素，運用單因素實驗法優(yōu)選沖和凝膠的處方，并進行3批中試放大實驗，以驗證處方及工藝的合理。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ZRS-8G型智能溶出試驗儀：天津海益達科技有限公司。JA2103N Electronic Balance電子天平：上海精密科學儀器有限公司。GSP-9080 MBZ隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。KQ-300B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。Brookfield DV-Ⅲ+ULTRA流變儀：美國Brookfield公司。pH計Mettler Toledo：瑞士梅特勒.托利多pH計。RW20 digital攪拌器：上海依肯機械設備有限公司。Agilent 1200高效液相色譜儀（DAD檢測器）：美國Agilent公司。透析袋（美國進口分裝，D27 mm，截留分子質量3 500）。微孔濾膜（德國Membrana公司，孔徑0.45 μm）。

1.2試藥 昆明山海棠、赤芍、獨活、白芷、石菖蒲提取物：由天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院中藥化學實驗室提供?？ú?34、971 NF、974 NF、981 NF、U10 NF：美國Noveon。甘油（供注射用）：汕頭市紫光古漢氨基酸有限公司。三乙醇胺（藥用級）：江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司。羥苯乙酯：西隴化工股份有限公司。亞硫酸氫鈉（藥用級）：江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司。異丙醇（分析純）：天津市化學試劑一廠。無水乙醇（分析純）：天津康科德科技有限公司。油酸：天津市化學試劑廠。EDTA-2Na：天津市光復精細化工研究所。無水亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠。色譜純乙腈(特級品)：天津市康科德科技有限公司。去離子水：Miliipore超純水系統(tǒng)（M3LL3Q/30 L）制備。

2 方法與結果

2.1P-B篩選實驗設計及響應值 基質（卡波姆）、保濕劑（甘油）、穩(wěn)定劑（亞硫酸氫鈉、EDTA-2Na）、pH值、載藥量等因素對沖和凝膠的黏度、芍藥苷和蛇床子素的穩(wěn)定性有一定的影響。在預實驗的基礎上，選擇對沖和凝膠的性質有影響的6個因素作為考察對象，各因素及水平安排見表1。按處方制備沖和凝膠，測定黏度及加速實驗（60℃，48 h）后芍藥苷和蛇床子素含量變化。

表1 P-B實驗設計的因素與水平

按實驗次數(shù)為12的P-B設計表配制因素和水平，進行實驗，各指標的測定結果見表2。

表2 Plackett-Burman實驗設計及響應值

2.2數(shù)據(jù)處理與結果分析 利用MINITAB軟件對P-B實驗結果進行分析，比較各因素的P值和可信度，選擇可信度大于85%的因素作為顯著影響因素。各因素效應的顯著性分析結果見表3。

表3 各因素響應值的顯著性分析結果

從表3可以看出，各因素對響應值（黏度）影響的顯著性順序依次為：卡波姆＞pH值＞載藥量＞甘油＞EDTA-2Na＞亞硫酸氫鈉，其中卡波姆、pH值對沖和凝膠的黏度差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在85%的置信水平條件下，載藥量、甘油對沖和凝膠的黏度差異顯著（P＜0.15），且載藥量、甘油也是凝膠劑的組成部分，因此也把兩者作為顯著性因素考慮。各因素對響應值芍藥苷含量影響的顯著性順序依次為：pH值＞亞硫酸氫鈉＞載藥量＞甘油＞EDTA-2Na＞卡波姆，其中pH值、亞硫酸氫鈉，在85%的置信水平條件下，對沖和凝膠中芍藥苷穩(wěn)定性差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.15），因此把兩者作為顯著性影響因素考慮。各因素對蛇床子素穩(wěn)定性的影響均無統(tǒng)計學意義。

利用MINITAB軟件對P-B實驗結果擬合各因素對不同指標的標準化效應的正態(tài)圖。各因素對響應值的影響，呈現(xiàn)不同的相關性及顯著性，結果見圖1。

圖1中A、B、C中各有6個點，分別是X1-X6，6個因素。斜線為標準線，各因素偏離標準線的距離，表明其對響應值的影響程度。各圖的響應值分別是：A黏度（α=0.05）；B芍藥苷含量P值（α=0.15）；C蛇床子素含量P值（α=0.05）

各因素對響應值的影響呈現(xiàn)不同的相關性，即正相關（標準化效應值＞0）或負相關（標準化效應值＜0）。離直線越遠，影響顯著性越大。卡波姆、pH值、甘油與黏度呈正相關，隨著各因素量的增加，黏度也隨著增大，且卡波姆和pH值對黏度的影響最大。而載藥量與黏度呈負相關，隨著載藥量的增加，黏度逐漸降低。pH值對芍藥苷的穩(wěn)定性的影響呈現(xiàn)負相關，pH增大則芍藥苷穩(wěn)定性降低，與文獻報道[6]相一致，亞硫酸氫鈉對芍藥苷的穩(wěn)定性的影響呈現(xiàn)正相關。蛇床子素比較穩(wěn)定，各因素對其影響均不顯著，與文獻報道[7]一致。

圖1 各因素對不同指標的標準化效應的正態(tài)圖

2.3單因素實驗對處方優(yōu)化 卡波姆、載藥量、甘油、pH值、亞硫酸氫鈉等主要因素，影響著制劑的黏度及芍藥苷的穩(wěn)定性，且呈不同相關性。因此繼續(xù)采用單因素實驗法進行篩選，以優(yōu)化沖和凝膠的處方。

2.3.1卡波姆用量及載藥量的優(yōu)化 卡波姆的用量與載藥量凝膠的成型性和穩(wěn)定性都會產(chǎn)生很大影響?？紤]到中藥提取工藝出膏率的批間差異，將載藥量（以提取物計）在20%預設值的基礎上，上浮至30%進行基質用量的考察。

分別制備卡波姆用量為0.5%、1%、1.5%的沖和凝膠，使載藥量分別為20%和30%，其他處方成分相同。以顏色、外觀性狀、質地、涂布性等為考察指標，以確定沖和凝膠中卡波姆濃度。結果見表4。

表4 卡波姆濃度的篩選結果

由表4可以看出，卡波姆濃度為1.5%時，載藥量為20%、30%時，均成紅棕色凝膠狀態(tài)，質地均勻細膩、易涂布、離心不分層穩(wěn)定性好，符合凝膠劑的基本質量要求。因此，選擇沖和凝膠的卡波姆濃度為1.5%、可以載藥30%。

2.3.2甘油用量的優(yōu)化 甘油作為凝膠劑的常用保濕劑，不僅有利于皮膚保濕、養(yǎng)護，而且對提高制劑的光澤度、維持劑型穩(wěn)定性也很重要，其常用的濃度范圍為5%～20%。

將甘油用量分別設計為5%、8%、10%、12%、15%和20%，其他處方成分相同，制備沖和凝膠。以顏色、質地、涂布性、黏度（25±2）℃、保濕率（%）等為考察指標，對沖和凝膠中甘油的用量進行篩選。

其中，保濕率的測定參照文獻方法[8]，將飽和碳酸鉀溶液于密封的干燥器中，放置于室溫（22±2）℃，使干燥器內的相對濕度為43%，精密稱取1 g沖和凝膠置于直徑為50 mm的稱量瓶中（帶蓋），分別放置于上述密封干燥器中，48 h后取出稱取各試樣的質量，比較放置前后的質量差。計算保濕率（%）。保濕率（%）=[（48 h后凝膠劑的質量-放置前的質量）/放置前的質量]×100。結果見表5。

表5 甘油用量的篩選結果

由表5可知，凝膠劑的保濕率隨著甘油量的增加而增大。在兼顧保濕性和穩(wěn)定性的同時，凝膠劑也應具有較好的涂布性。由此可知，當甘油用量大于12%時，凝膠劑涂布性不佳。綜合考慮，選擇甘油的用量為12%。

2.3.3pH值的優(yōu)化 以卡波姆為凝膠基質的凝膠劑，屬于pH值敏感型。隨著pH值的增大，黏度逐漸增大，pH值為6～12時最為黏稠。而在保證凝膠具有一定黏附性的同時，也要兼顧藥物的穩(wěn)定性，故應對凝膠劑適宜的pH值范圍進行考察。

制備相同處方、不同pH值的沖和凝膠，以顏色、質地、涂布性、氣味、黏度（25℃）、加速實驗前后蛇床子素和芍藥苷的含量變化百分率為考察指標，選擇合適的pH值范圍。結果見表6、圖2。

由表6和圖2可知，在pH值為4.33～6.66時，沖和凝膠的各項指標結果均較好，主要藥效成分及指標成分——芍藥苷和蛇床子素均穩(wěn)定。故沖和凝膠的pH值取整，選擇為4.5～6.0。

表6 pH值的篩選實驗結果

圖2 pH值對芍藥苷和蛇床子素含量的影響

2.3.4亞硫酸氫鈉用量的優(yōu)化 為了增加制劑的穩(wěn)定性，對亞硫酸氫鈉的用量進行考察。按已選定的基質和附加劑，配制沖和凝膠樣品，分成若干份，按常用量加入不同用量的亞硫酸氫鈉，對用量進行篩選。結果見表7。

表7 亞硫酸氫鈉用量的篩選結果

由表7可知，在亞硫酸氫鈉濃度為0.175%時，沖和凝膠中各個指標的變化最小，穩(wěn)定性最好。故亞硫酸氫鈉的用量選擇為0.175%。

2.4工藝驗證 按照所確定的處方和工藝，以水和甘油為溶解及分散介質，以1.5%卡波姆981為凝膠基質，12%甘油為保濕劑，0.175%亞硫酸氫鈉為穩(wěn)定劑，三乙醇胺調節(jié)pH值至4.5～6.0制備沖和凝膠。

重復制備3批樣品，加速實驗后，以外觀性狀、涂布性、pH值、離心穩(wěn)定性等為指標考察處方的穩(wěn)定性。結果見表8。

三批樣品各項指標均較好，驗證結果表明本沖和凝膠的處方較優(yōu)。

3 結論

本研究通過簡單、經(jīng)濟的P-B篩選設計，篩選卡波姆、pH值對沖和凝膠的黏度具有顯著性影響（P＜0.05）。在85%的置信水平條件下，載藥量、甘油對沖和凝膠的黏度影響顯著，pH值、亞硫酸氫鈉對沖和凝膠中芍藥苷穩(wěn)定性影響顯著。

表8 工藝驗證的實驗結果

通過單因素實驗法對沖和凝膠的處方進行進一步優(yōu)選，確定制劑的最佳處方為：1.5%卡波姆981+12%甘油+0.175%亞硫酸氫鈉+三乙醇胺調節(jié)pH值至4.5～6.0，載藥量20%～30%。中試放大，樣品質量均穩(wěn)定，表明沖和凝膠處方及工藝較合理。

卡波姆對凝膠的黏度的影響最顯著，呈正相關。由于卡波姆分子結構中含52%～68%的酸基團，因此具有一定的酸性，可用堿性物質中和，形成凝膠。在pH值6～11時，黏度最大。載藥量與沖和凝膠的黏度呈負相關，載藥量越大，凝膠劑的黏度越小。曾有文獻報道[9-10]，中藥提取物中存在很多的離子，這些離子的量和游離狀態(tài)都無法知道，所以這些離子的存在直接影響到凝膠體系的黏度。pH值對芍藥苷的穩(wěn)定性有顯著性的影響，芍藥苷在酸性條件下穩(wěn)定，堿性高溫條件下不穩(wěn)定。

處方篩選實驗可以通過實驗設計[11-14]，或多種實驗設計組合，進行優(yōu)選。P-B設計可以用較少的實驗達到分析各因素主效應的效果，在不大量增加實驗次數(shù)的情況下給出較多的信息，包括影響是否顯著，影響為正相關還是負相關。P-B設計可以針對響應值，通過響應優(yōu)化器給出優(yōu)化處方，但由于各因素水平僅為2個，跨度寬泛，僅供參考。因此本實驗通過單因素實驗進一步優(yōu)化，篩選出了最優(yōu)處方。據(jù)比較，優(yōu)化后的處方要優(yōu)于響應器給出的處方。

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Optimization of Chonghe gel formulation using Plackett-Burman design and single-factor design

WANG Yan-ming1,2,DU Shou-ying1,3,WANG Ya-jing1,ZHANG De-qin1,SUN Shi-zhen1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Tianjin 300193,China;2.Harbin Medical University(Daqing),Daqing 163319,China;3.School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China）

[Objective]To choose the optimal formulation for the Chonghe gel prescription.[Methods]The viscosity of the preparation and the stability of paeoniflorin and osthole were served as evaluation criterions.The experiment would inspect the significance of influential factor of preparation by Plackett-Burman design.Then the prescription was further optimized for those factors.[Results]Plackett-Burman design tests showed that the amount of Carbomer,drug loading,glycerol,pH value were significant influencing factors on the formulation viscosity.The amount of sodium bisulfite,pH value were major influencing factors of stability of paeoniflorin.By further optimization of the various factors,the final prescription was optimized as follows：carbomer 981 was 1.5%,glycerol was 12%,sodium bisulfite was 0.175%,pH value was at 4.5 to 6.0 adjusting by the triethanolamine,the amount of the drug loading was 20%to 30%.[Conclusion]The optimized formulation is proved to be reliable,stable and available for meeting the preparation requirements.

Plackett-Burman design;Chonghe gel;formulation optimization

R285

：A

：1673－9043（2014）04－0225-05

2014-03-11）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.10

天津市高校雙五科技計劃項目（SW20080007）；“重大新藥創(chuàng)新制”科技重大專項資助項目（2012ZX09103201-046）。

王艷明（1978-），男，博士研究生，主要從事中藥新制劑研究。

王亞靜，E-mail:yajing022@163.com。