王 芳，陳介南*，張 林，閆興偉，劉 娜

（中南林業(yè)科技大學(xué) 國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

隨著世界人口迅速增長(zhǎng)以及化石燃料由短缺變枯竭，能源危機(jī)問(wèn)題成為人類面臨的最主要挑戰(zhàn)。尋找廉價(jià)的、不污染環(huán)境的可再生新能量來(lái)源日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。生物質(zhì)資源與化石燃料不同，其屬于可再生性資源。生物質(zhì)最主要來(lái)源于綠色植物，地球上每年光合作用可產(chǎn)生高達(dá)150～200億t的植物干物質(zhì)，其中一半以上是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)[1]。纖維素的基本結(jié)構(gòu)單位是纖維二糖，由D-葡萄糖分子以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖。由于纖維素結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、含量豐富且具有可生物降解性的特點(diǎn)，如果能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)把地球上的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成單糖，對(duì)于緩解世界能源危機(jī)及固體廢棄物資源化具有不可估量的價(jià)值[2]。

纖維素酶在轉(zhuǎn)化纖維素和半纖維素方面起著決定性的作用。自然界中能生產(chǎn)纖維素酶的微生物種類很多，但是大多數(shù)由于產(chǎn)纖維素酶能力低且酶系組分不完全，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。其中，里氏木霉由于產(chǎn)量高及其安全無(wú)毒性成為主要的纖維素酶生產(chǎn)菌株之一。從20世紀(jì)90年代初開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外就開(kāi)始利用里氏木霉產(chǎn)纖維素酶，并對(duì)產(chǎn)酶的工藝條件開(kāi)始進(jìn)行摸索。近年來(lái)，人類通過(guò)誘變選育、基因工程、原生質(zhì)體融合等菌種選育方法，在纖維素酶的生產(chǎn)方面取得了較為突出的進(jìn)展[3-5]。

1 里氏木霉及其纖維素酶

1.1 纖維素酶

纖維素酶是指降解纖維素的一組酶的總稱，其不是單個(gè)酶，而是起協(xié)同作用的多組分復(fù)合酶系。纖維素酶主要由3種酶組成：內(nèi)切型-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.4），外切型-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱纖維二糖水解酶）和纖維二糖酶（EC3.2.1.21，也稱β-葡萄糖苷酶）[6]。纖維素酶特異性高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，降解過(guò)程中不會(huì)污染環(huán)境等，是將纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的關(guān)鍵。

纖維素酶和一般酶反應(yīng)不一樣，其主要區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系。在水解纖維素為葡萄糖的過(guò)程中，必須依靠不同組分之間的協(xié)同作用才能完成。其作用機(jī)理如圖1所示[7]。大分子首先在內(nèi)切葡聚糖酶的作用下產(chǎn)生新的游離末端，然后由外切葡聚糖酶在新產(chǎn)生的還原端或非還原外切纖維素鏈，生成纖維素二糖（或葡萄糖），再由β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成兩個(gè)葡萄糖。

圖1 纖維素酶作用機(jī)制Fig.1 Action mechanism of cellulose enzyme

目前，纖維素酶的產(chǎn)酶菌株的活力還不是很高，致使其生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。所以，酶解成本過(guò)高是制約纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇的主要障礙，其占總生產(chǎn)成本的比例很大，只有將酶的成本降低，生物乙醇才有可能與石油競(jìng)爭(zhēng)。纖維素酶的生產(chǎn)是成功的酶促轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)為生物乙醇的重要因素之一。因此，選育出高產(chǎn)纖維素酶且酶活性穩(wěn)定的產(chǎn)酶菌株至關(guān)重要。

1.2 產(chǎn)纖維素酶的主要微生物

產(chǎn)纖維素酶的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌。不同微生物生產(chǎn)的纖維素酶的各組分比例有著顯著差異，且降解纖維素的能力也各不相同。其中，雖然放線菌比真菌耐受高溫和酸堿，但由于生長(zhǎng)繁殖慢且纖維素酶的產(chǎn)量低，研究較少[8]。另外，細(xì)菌的酶產(chǎn)量也不高，且以內(nèi)切酶為主，大多數(shù)酶對(duì)結(jié)晶纖維素沒(méi)有活性，所生產(chǎn)的纖維素酶是胞內(nèi)酶或吸附于細(xì)胞壁上，分離純化難度大，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。

而在絲狀真菌中，產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮孢菌屬（Fusarium）。其中最著名的是里氏木霉（Trichoderma reesei），其在生產(chǎn)纖維素酶方面具有很多優(yōu)點(diǎn)[9]，如生長(zhǎng)環(huán)境粗放，便于控制和培養(yǎng)；穩(wěn)定性好，不易退化；產(chǎn)纖維素酶活力高；生產(chǎn)的纖維素酶為胞外酶，易于分離純化；且安全無(wú)毒，無(wú)污染。另外，里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶系各組分結(jié)構(gòu)較為合理，包括5個(gè)內(nèi)切酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ和EGⅤ（60%～80%），兩個(gè)外切酶CBHⅠ、CBHⅡ（20%～36%）以及兩種β-葡萄糖苷酶BGⅠ和BGⅡ（1%），能更有效的水解轉(zhuǎn)化纖維素為葡萄糖。因此，里氏木霉被公認(rèn)為是目前最具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的纖維素酶生產(chǎn)菌株。

1.3 里氏木霉的生產(chǎn)工藝

里氏木霉的生產(chǎn)工藝可以分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)深層發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵是以小麥、甘蔗等農(nóng)作物的秸桿為原料，類似于自然狀態(tài)下真菌的生長(zhǎng)條件，其優(yōu)點(diǎn)是纖維素酶系完全，有利于降解天然纖維素；投入成本低，操作工藝簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是生產(chǎn)的纖維素酶很難提純，生產(chǎn)效率低，容易污染，勞動(dòng)強(qiáng)度大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。史通等[10]對(duì)里氏木霉RUT-C30與黑曲霉NL02固態(tài)混合發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到132.45 IU/g。

液態(tài)深層發(fā)酵是在通氣攪拌式發(fā)酵罐中進(jìn)行，里氏木霉在產(chǎn)酶過(guò)程中受到著多因素的影響，一般可以通過(guò)控制培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分比例、碳氮源、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、含水量、誘導(dǎo)劑、表面活性劑及溶氧水平等因素進(jìn)行優(yōu)化。液態(tài)深層發(fā)酵的缺點(diǎn)是技術(shù)水平先進(jìn)，難度大；投資設(shè)備大，成本高。優(yōu)點(diǎn)是原料利用率高，產(chǎn)量好；發(fā)酵條件易于控制，不易污染；機(jī)械自動(dòng)化程度高，可大規(guī)模生產(chǎn)；從而成為近年來(lái)研究的主要培養(yǎng)方式。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，里氏木霉液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶中濾紙酶活多數(shù)穩(wěn)定在10 U/mL左右。王涫等[11]對(duì)里氏木霉FST-1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基及條件進(jìn)行優(yōu)化，濾紙酶活力達(dá)到13.0 U/mL。張曉月等[12]研究了發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)里氏木酶RUT-C30產(chǎn)纖維素酶活力的影響，結(jié)果表明，濾紙酶活力達(dá)到9.13 IU/mL，較之前提高了72.26%。AHAMED A等[13]研究了機(jī)械攪拌對(duì)里氏木霉RUT-C30在發(fā)酵罐中生產(chǎn)纖維素酶活力的影響，研究結(jié)果表明，沒(méi)有機(jī)械攪拌產(chǎn)酶效果較好，濾紙酶活力（filter paper activity，F(xiàn)PA）達(dá)到17U/mL，羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCA）活力達(dá)到11.8 U/mL。

2 產(chǎn)纖維素酶里氏木霉菌株的選育

雖然里氏木霉生產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性較高，但也存在一些缺點(diǎn)，如生產(chǎn)的纖維素酶表現(xiàn)出較低的β-葡萄糖苷酶的活性，會(huì)導(dǎo)致纖維二糖的積累，而纖維二糖的積累對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶具有很強(qiáng)的反饋抑制作用，從而導(dǎo)致纖維素的糖化效率不高[14]。為了克服里氏木霉的這些不足，提高纖維素酶的各組分酶活以及防止菌種退化，采用的適當(dāng)菌種選育方法改良菌種的遺傳是很有必要的。常用的菌種選育方法有自然育種、誘變育種、基因工程育種、原生質(zhì)體融合育種、纖維素酶的分子改造等。

2.1 自然育種

自然誘變是指對(duì)微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過(guò)人工處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法，是一種簡(jiǎn)單易行的育種方法。缺點(diǎn)是微生物的自然突變率很低，難以提高菌株的產(chǎn)酶水平。李榮杰[15]從土壤中篩選出一株酶活較高的里氏木霉FYFJ928，其發(fā)酵水平經(jīng)優(yōu)化后可達(dá)到15.6 IU/mL。孫海彥等[16]從熱帶雨林土壤中分離纖維素酶高產(chǎn)菌，經(jīng)鑒定為里氏木霉，其FPA活力達(dá)到5.8 U/mL，CMCA活力達(dá)到10.2 U/mL。AKINOLA G E等[17]從土壤中通過(guò)平板篩選出6株纖維素酶產(chǎn)量較高的木霉屬菌株，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活最高。

2.2 誘變育種

誘變育種是選育出高產(chǎn)纖維素酶突變菌株的一種簡(jiǎn)單高效的方法，它能夠使菌株的突變頻率比自然突變提高幾百倍至幾千倍，從而大幅度改善菌種特性。優(yōu)點(diǎn)是效果好、操作簡(jiǎn)單、條件和設(shè)備要求較低。缺點(diǎn)是突變不定向，具有盲目性。誘變育種可分為物理誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合交替誘變。

2.2.1 物理誘變

物理誘變常用的誘變劑種類很多。有非電離輻射類的紫外線、激光和離子束等，及能夠引起電離輻射的X射線、α射線、β射線、γ射線、快中子等[18]。

非電離輻射中紫外線由于其操作簡(jiǎn)單、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)，是微生物育種中應(yīng)用廣泛的有效誘變劑之一。傅力等[19]對(duì)里氏木霉DWC原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，得到突變菌株DWC5，其CMCA、FPA分別達(dá)到820.4 mg/（mL·h）和23.2 mg/（mL·h），為工業(yè)生產(chǎn)中提高纖維素的生物轉(zhuǎn)化率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。IKE M等[20]以里氏木霉ATCC66589為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1，其濾紙酶活分別達(dá)到257 U和281 U。張素敏等[21]利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達(dá)到64.2 U/mL。

另外，低能離子注入法作為一種新型的生物誘變手段，具有損傷輕、突變率高、突變譜廣等優(yōu)點(diǎn)。張寧等[22]利用氮離子注入技術(shù)對(duì)里氏木霉進(jìn)行誘變選育，研究表明，在注入劑量為250×1014N+/cm2的條件下得到突變幅度較大菌株，獲得3株纖維素酶高產(chǎn)突變菌150-1、150-2、250-6，其平均酶活力較出發(fā)菌株增加了24.3%，建立了纖維素酶高產(chǎn)菌株的快速篩選方法，并為研究氮離子束的誘導(dǎo)機(jī)理提供依據(jù)。

電離輻射中，質(zhì)子束照射與X射線、γ射線和電子束相比較，由于其局部高能量的特性已經(jīng)成為一個(gè)新的突變方法。JUNG Y R等[23]質(zhì)子數(shù)照射誘變里氏木霉KCTC6950，得到突變體菌株T-2（MT-2），其濾紙酶的活性增加了65%，CMCA活性增長(zhǎng)了46%，β-葡萄糖苷酶的活性增加了213%。

2.2.2 化學(xué)誘變

在化學(xué)誘變劑中，主要有烷化劑、核酸堿基類似物和吖啶化合物。其中烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應(yīng)，故更易誘發(fā)基因突變。最常用的烷化劑有亞硝基乙基脲烷（nitroso ethyl urea alkanes，NEU）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）、硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）等。DURAND H等[24]分別用亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝酸鈉誘變里氏木霉QM9414，最終，在NTG的誘導(dǎo)下得到一株穩(wěn)定性較好的突變菌株CL847，F(xiàn)PA酶活最高達(dá)到5.2 U/mL，較出發(fā)菌株提高了4倍。

2.2.3 復(fù)合交替誘變

單一誘變往往具有很多缺點(diǎn)，如突變不定向，效率低及易發(fā)生回復(fù)突變等。針對(duì)這一問(wèn)題，很多學(xué)者把研究的熱點(diǎn)放到了復(fù)合交替誘變上。復(fù)合交替誘變是指利用兩種或兩種以上的誘變劑對(duì)微生物以復(fù)合交替處理的方式進(jìn)行誘變。因不同誘變劑的作用機(jī)理不同，相應(yīng)的對(duì)微生物的誘變效應(yīng)也不相同。所以如果誘變劑搭配合理，復(fù)合交替誘變更易得到理想突變株。

GADGIL N J等[25]利用紫外線和亞硝酸鈉對(duì)里氏木霉QM9414進(jìn)行復(fù)合交替誘變，突變株較出發(fā)菌株濾紙酶活提高至1.5倍，CMCA活力提高至1.8倍，β-葡萄糖苷酶活提高至1.06倍。HAO X C等[26]通過(guò)N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍和紫外線誘變得到突變菌株里氏木霉WX-112，并用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，濾紙酶活提高至10.6 IU/mL。HE J等[27]利用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍和紫外線兩種誘變劑先后誘導(dǎo)里氏木霉RUT-C30，得到突變菌株NU-6，其濾紙酶活、CMCA活力及β-葡萄糖苷酶活分別達(dá)到6.2 U/mL、54.2 U/mL、0.39 U/mL。張曉烜等[28]對(duì)里氏木霉40359進(jìn)行紫外線、亞硝酸鈉、硫酸二乙酯誘變，得到一株穩(wěn)定性較好的菌株YB40359，F(xiàn)PA酶活達(dá)到57.31 U/mL，提高了87.12%；CMCA活力達(dá)到142.60 U/mL，提高了58.66%。這些研究對(duì)里氏木霉高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其工業(yè)化應(yīng)用具有顯著意義。

2.3 基因工程育種

基因重組技術(shù)又稱為遺傳工程，是指在體外通過(guò)人工剪接，將不同來(lái)源的DNA分子組成一個(gè)雜合DNA分子（DNA分子重組體），然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)[29]。可以從不同產(chǎn)纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的基因重組在一起并高效表達(dá)，具有定向性，是選育出高產(chǎn)纖維素酶菌株的有效途徑。表1列出了已成功在里氏木霉中克隆表達(dá)的基因。

表1 已成功在里氏木霉中克隆表達(dá)的基因Table 1 Successfully expressed gene in the cloning of Trichoderma reesei

2.4 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合技術(shù)是指用自然或人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體融合在一起，以期獲得兼有雙親遺傳性狀穩(wěn)定的重組子。它具有雜交頻率高、重組體種類多及遺傳物質(zhì)傳遞的更為完整等優(yōu)點(diǎn)[35]，但它的遺傳穩(wěn)定性還需要研究。里氏木霉具有較高的內(nèi)切和外切葡聚糖酶活性，而黑曲霉有較高的β-葡萄糖苷酶活性，為了選育出更好的纖維素酶生產(chǎn)菌，可將里氏木霉和黑曲霉進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選到具有這兩屬優(yōu)點(diǎn)的融合子。EI-BONDKLY A M等[36]將木霉屬與黑曲霉通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)融合。其中，里氏木霉NRRL 18670與黑曲霉NRRL 599融合獲得的融合子（1/5）濾紙酶活，CMCA、β-葡萄糖苷酶活相較于黑曲霉分別提高了200%、212.5%、66.7%。原生質(zhì)體融合在獲得高產(chǎn)纖維素酶菌株方面具有廣闊的發(fā)展前景。

2.5 纖維素酶的分子改造

纖維素酶在很多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不同的行業(yè)由于目的不同所要求的酶學(xué)性質(zhì)也不相同。如有些生物工藝要求纖維素酶耐高溫，而另外有些則要求纖維素酶耐堿性或耐酸性。而真菌生產(chǎn)的天然纖維素酶還不能滿足人們的實(shí)踐要求，因此對(duì)纖維素酶進(jìn)行有目的的分子改造很有必要[37]。ZHANG J W等[38]對(duì)里氏木霉RUT C30的β-葡萄糖苷酶基因BGLⅠ進(jìn)行改造，獲得3個(gè)轉(zhuǎn)化子B2、B12、B15，其中β-葡萄糖苷酶活力最高達(dá)到5.90 IU/mg，提高到出發(fā)菌株的3.7倍；濾紙酶活最高達(dá)到1.42 IU/mg，提高到出發(fā)菌株2.29倍。

3 應(yīng)用和前景展望

目前，里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶在食品加工、釀造、飼料、醫(yī)藥、紡織、造紙工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域都有重要的用途[39]。在食品加工工業(yè)中[40]，用纖維素酶對(duì)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行預(yù)處理相較于傳統(tǒng)的加熱蒸煮或酸堿處理有很多優(yōu)點(diǎn)，如使植物組織膨化松軟，減少農(nóng)產(chǎn)品香味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，改善口感，更利于消化，節(jié)約處理時(shí)間等。另外，纖維素酶也應(yīng)用于發(fā)酵和釀造等工業(yè)中。動(dòng)物飼料中含有大量纖維素，而大部分飼養(yǎng)動(dòng)物（除某些反芻動(dòng)物以外）都不具有分解纖維素的能力，造成資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。纖維素酶一方面以添加劑的形式加入到動(dòng)物飼料中；另一方面纖維素酶用于動(dòng)物飼料的預(yù)處理，如秸稈或其他粗飼料。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，用于中草藥有效成分的提取，中藥提取成分分析和治療某些疾病等。纖維素酶還在紡織和造紙工業(yè)中都有重要應(yīng)用。

里氏木霉在生產(chǎn)纖維素酶具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但要獲得高效的纖維素酶生產(chǎn)菌株，還需要長(zhǎng)時(shí)間的努力。從20世紀(jì)90年代初人們就開(kāi)始對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行研究，但是里氏木霉在生產(chǎn)纖維素酶方面還是具有很多缺點(diǎn)，如生產(chǎn)技術(shù)落后、規(guī)模小、生產(chǎn)成本高、酶活性低等，這極大地限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。目前，可以通過(guò)誘變育種、基因重組、原生體融合技術(shù)、雜交育種、分子改造等各種行之有效的方法，以期提高纖維素酶的質(zhì)量和產(chǎn)量，獲得纖維素酶高產(chǎn)菌。另外，可以選擇廉價(jià)的工業(yè)化原料為碳氮源，節(jié)約生產(chǎn)成本。隨著不斷深入的研究里氏木霉，以及高新技術(shù)的快速發(fā)展，獲得適合工業(yè)生產(chǎn)的高活力纖維素酶菌株的前景將是一片光明。

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